132-N-（2-羟乙基）-153-N-（2-羟乙基）-173-甲氧羰基二氢卟吩e6-131-152-二酰胺的合成工艺及光学性质研究*

朱国华，金英学

（哈尔滨师范大学化学化工学院，黑龙江哈尔滨150025）

科研与开发

132-N-（2-羟乙基）-153-N-（2-羟乙基）-173-甲氧羰基二氢卟吩e6-131-152-二酰胺的合成工艺及光学性质研究*

朱国华，金英学*

（哈尔滨师范大学化学化工学院，黑龙江哈尔滨150025）

本文以叶绿素-a为起始原料，经取代，加成等反应合成了一种新型叶绿素二氢卟吩衍生物132-N-（2-羟乙基）-153N-（2-羟乙基）-173-甲氧羰基二氢卟吩e6-131-152-二酰胺（Chlorin Amide e6，简称CAE）,其化学结构均经UV-Vis，1H NMR，13C NMR及元素分析予以证实。通过对CAE合成工艺研究找到了最佳合成条件，并对光学性质和合成反应机理进行了研究。

叶绿素-a；二氢卟吩；合成工艺；光学性质；反应机理

光动力疗法（Photodynamic therapy简称PDT）是在氧的参与下，光敏剂经一定波长（630～800nm）光照射，产生活性氧（reactive oxygen substance,简称ROS）进而杀死癌变组织而不损伤正常组织的一种治疗方法[1-4]。光敏剂接受特定波长光的光能后,由基态变成激发态,处于激发态的光敏物质很不稳定,迅速经过化学退激过程释放出能量而返回基态,在有氧条件下,这一能量释放的过程,产生单线态氧，使细胞的结构和功能受到严重影响,从而干扰肿瘤细胞的生长并导致其死亡[5]。在光动力疗法中，光敏剂、光和氧是必不可少的三要素，其中光敏剂是光动力疗法的核心[6]。传统光敏剂存在光穿透组织深度有限，水溶性较差，容易在体内沉积等缺点[7]。为了克服这些缺点，近几年发展了叶绿素二氢卟吩光敏剂[8]。叶绿素（Chls）是自然界最重要的色素，具有π共轭环四吡咯结构，在一个吡咯环外连接一个五元环。叶绿素-a在蓝光区（～430nm）和红光区（～660nm）有强烈的吸收,同时是很好的荧光团，且具有较高的量子产率[9]。因此，叶绿素二轻卟吩成为了理想光敏剂之一。

本课题组致力于研究叶绿素二氢卟吩光敏剂，并取得了一定的成果[10,11]。基于前期研究，本文以叶绿素-a为起始原料，经5%硫酸甲醇溶液降解得到脱镁叶绿酸-a甲酯（Mpa），然后在其13位和15位引入醇酰胺，得到了132-N-（2-羟乙基）-153-N-（2-羟乙基）-173-甲氧羰基二氢卟吩e6-131-152-二酰胺（Chlorin Amide e6，简称CAE）。本文细致研究了CAE的制备工艺，并讨论它的合成机理，同时对其光学性质（紫外可见吸收光谱、荧光光谱）进行了系统的研究。

图1 CAE的合成路线Fig.1 The synthetic route of CAE

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Perkin-Elmer2400型元素分析仪；Varian-400型核磁共振仪（TMS为内标）；岛津UV-vis 2600紫外分光光度仪；Perkin-Elmer LS55荧光分光光度仪。

所用试剂均为分析纯，脱镁叶绿酸-a甲酯（Mpa）按文献[12]制备。

1.2 CAE的合成

将50mg（0.0824mmol）Mpa溶解于12mL三氯甲烷中，搅拌下加入0.025mL乙醇胺，N2保护下室温避光搅拌2h。浓缩反应混合物，室温下静置10h。依次加入30mL二氯甲烷和30mL水，分出二氯甲烷层，用30mL水洗3遍，加入无水Na2SO4干燥，经硅胶柱层析分离，洗脱剂为V（甲醇）∶V（二氯甲烷）=1∶15，得到黑色固体粉末，产率为60%。UV-vis（EtOH）λmax（relative intensity）:399（1.392）,499.5（0.122）, 527（0.033）,607（0.042）,662.5（0.457）nm;1H-NMR（400 MHz,CDCl3）δ 9.61（s,1H,5-H）,9.60（s,1H, 10-H）,8.79（s,1H,20-H）,8.04（dd,J=17.8,11.5 Hz,1H,31H）,6.34（d,J=18.5 Hz,1H,1H,32-H（E））, 6.14（d,J=11.5Hz,1H,32-H（Z））,5.40-5.27（m,2H, 15-CH2）,4.44（m,1H,18-H）,4.33（m,1H,17-H）,3.94-3. 76（m,4H,155-CH2,134-CH2）,3.74-3.64（m,2H, 81-CH2）,3.56（s,3H,173-OCH3）,3.47（s,3H, 12-CH3）,3.46（s,3H,2-CH3）,3.26（s,3H,7-CH3）, 2.41（m,1H,171-CH2）,2.25-2.07（m,3H,171-CH2, 172-CH2）,1.70（d,J=7.2 Hz,3H,18-CH3）,1.66（t,J =7.6 Hz,3H,82-CH3）,1.30-1.04（m,4H,154-CH2, 133-CH2）,-1.77（s,1H,NH）,-1.98（s,1H,NH）.13C-NMR（MeOD-d4）δ（ppm）:10.8,11.8,17.8,18. 4,19.9,23.5,29.5,30.6,31.8,32.0,33.9,38.7,42.9, 44.1,50.4,52.8,54.5,58.3,61.6,61.7,94.8,99.1, 101.9,103.7,121.5,129.5,130.6,135.2,136.1,136.8, 139.7,145.4,149.9,155.0,168.9,170.9,172.0,175.3, 175.8.Anal.calcd for C39H48N6O6:C 67.22,H 6.94,N 12.06;found C67.08,H 6.99,N12.23.

2 结果与讨论

2.1 CAE最佳合成条件的选择

2.1.1 Mpa和乙醇胺摩尔比对产率的影响50mg（0.0824mmol）Mpa和乙醇胺分别按不同摩尔比反应，结果如表1。其他条件一致，溶剂为三氯甲烷（12mL），反应温度25℃，反应时间2h，N2保护，避光。

表1 n（Mpa）∶n（乙醇胺）对产率的影响Tab.1 Influence of n（Mpa）∶n（ethanolamine）on yield

由表1可知，保持其它反应条件不变，只改变Mpa和乙醇胺摩尔比，反应产率不同。当Mpa和乙醇胺摩尔比逐渐增大至1∶5时，产率最大，继续增大乙醇胺的量产率基本保持不变，因此Mpa和乙醇胺最佳摩尔比为1∶5。

2.1.2 反应时间对产率的影响50mg（0.0824mmol）Mpa和0.025mL乙醇胺按不同的时间反应，结果如表2。其他条件一致，n（Mpa）∶n（乙醇胺）=1∶5，溶剂为三氯甲烷（12mL），反应温度25℃，N2保护，避光。

表2 反应时间对产率的影响Tab.2 Influence of reaction time on yield

由表2可知，当反应时间从0.5h增加至2.0h，产率逐渐提高，继续增加反应时间产率基本保持不变，因此，Mpa和乙醇胺最佳反应时间为2h。

2.1.3 反应温度对产率的影响50mg（0.0824mmol）Mpa和0.025mL乙醇胺在不同的温度下反应，结果如表3。其他条件一致，n（Mpa）∶n（乙醇胺）=1∶5，溶剂为三氯甲烷（12mL），反应时间2h，N2保护，避光。

表3 反应温度对产率的影响Tab.3 Influence of on reaction temperature

由表3可知，反应温度从15℃增加到25℃，产率由55.7%增加至60.2%。继续升温至三氯甲烷回流，产率反而逐渐降低。分析认为，随着温度的升高CAE结构中17位酯基可以继续和乙醇胺反应，得到副反应产物，因而产率降低。

综合表1,2,3得出Mpa和乙醇胺最佳反应条件为：n（Mpa）∶n（乙醇胺）=1∶5；反应时间2h；反应温度25℃。

2.1.4 最佳反应条件下多次试验Mpa和乙醇胺在最佳反应条件下进行反应。反应条件固定为：n（Mpa）∶n（乙醇胺）=1∶5；反应时间2h；反应温度25℃，N2保护，避光。5次同一条件下实验，结果见表4。

表4 重复试验结果Tab.4 The result of repeat experiments

由表4可知，重复5次平行试验得到平均产率为60.2%。在此条件下反应产率稳定可靠。

2.2 CAE光谱性质研究

2.2.1 紫外可见吸收光谱紫外可见吸收光谱是鉴定叶绿素二氢卟吩类化合物的重要手段，同时也是光动力治疗的重要依据。光动力治疗的光范围在630～800nm，在此范围内具有吸收峰的光敏剂均可用于光动力治疗。典型的叶绿素二氢卟吩类化合物在400nm附近有一个Soret带，在500～700nm有四个Q带，其中在660～700nm的Q带是敏感度和吸光度最强的Q带。在本文中，紫外可见吸收光谱测试条件为：（1）波长范围300～800nm；（2）溶剂为无水乙醇；（3）石英比色皿，宽度为1cm；（4）测试浓度为10-5mol·L-1；（5）测试温度25℃。CAE溶解在无水乙醇溶液中后在300～800nm吸收谱见图3。

图3 CAE紫外可见吸收光谱Fig.3 Ultraviolet visible absorption spectra of CAE

所有可见光区都有电子吸收谱带。最强的吸峰在399nm称为Soret峰，吸光度为1.392。在更长波长的吸收峰称为Q峰。499.5nm，527nm，607nm，662.5nm是4个Q峰，依次标记为Qx（0,1），Qx（0,0），Qy（0,1）和Qy（0,0），吸光度依次为0.122，0.003，0.042，0.457。x，y分别为偶极矩方向（如图4）。

Qy（0,0）峰比其他Q峰强度大，是叶绿素二氢卟吩特征吸收峰。CAE在Soret带以及Q带均有吸收，由此可推断其结构具有叶绿素二轻卟吩类化合物特征。虽然和Mpa相比Qy（0,0）吸收峰蓝移5.5nm，但是CAE的Qy（0,0）吸光度为0.457大于Mpa（0.443），水溶性远远大于Mpa，使得CAE作为光敏剂可以溶于血液，加之由于存在18-π电子芳香大环结构具有一定的脂溶性，CAE更容易渗透细胞膜富集在肿瘤细胞，最终将其杀死。

2.2.2 荧光光谱光动力治疗中光参与两个过程：（1）叶绿素二氢卟吩类光敏剂吸收630～800nm光；（2）吸收光后，叶绿素二氢卟吩类光敏剂由激发态S0激发至激发态S1,S2，……，由第一激发态S1返回至基态S0时发出荧光。光敏剂将发出的荧光传递至氧分子，氧分子接受光能后由三线态氧转变至单线态氧，从而不可逆转的破坏核酸，酶类和细胞的一些成分如线粒体，血浆以及核膜，最终导致肿瘤细胞程序性死亡[13]。光敏剂吸收近红外区域光后能否发出荧光以及荧光量子产率是光动力治疗的关键，发出的荧光越强，荧光量子产率越高，产生单线态氧的含量就越多，杀死肿瘤细胞的效果越好。因此，对光敏剂荧光光学性质的研究至关重要。CAE含有二氮杂[18]轮烯的芳香性碳架结构，具有非常强的共轭效，超强的共轭效应使得CAE吸收一定波长的光后能够发射强烈的荧光。本文中荧光光谱测试条件：（1）激发波长412nm；（2）狭缝宽度10nm/10nm；（3）溶剂为无水乙醇；（4）测试浓度10-5mol·L-1；（5）测试温度为25℃。用412nm光激发得到CAE荧光发射光谱见图5。

图5 CAE荧光光谱Fig.5 Fluorescence spectra of CAE

412nm激发后得到一个荧光发射峰，发射波长为669.5nm，荧光强度为890.9，虽然CAE荧光发射峰和Mpa相比蓝移6nm，但是其荧光强度高于高于Mpa（760.8），荧光量子产率高于Mpa，产生的单线态氧也较多，从而杀死肿瘤细胞结果要好。因此CAE作为光动力治疗中的光敏剂比Mpa更具有优势。

2.3 CAE合成机理

本文还探讨了CAE的反应机理，见图6。

脱镁叶绿酸-a甲酯131羰基-C=O中，由于O原子的电负性大于C原子的电负性，使得-C=O中双键的电子云倾向于O原子，这样-C=O中C原子具有一定的正电性。乙醇胺中N原子有一对孤电子，依据正负电荷相吸原理，乙醇胺中N原子首先加成到羰基C原子上，将双键打开，形成中间体Ⅰ。在中间体Ⅰ中151C原子带负电，132N原子带正电，该结构不稳定迅速转变为较稳定的中间体Ⅱ，中间体Ⅱ经分子内质子转移形成分子Ⅲ。由于乙醇胺过量，带有孤对电子的N原子继续进攻152羰基C原子形成中间体Ⅳ，经分子内质子转移将N原子上的质子H转移至甲氧基，质子化的甲氧基很容易脱去CH3OH，同时带负电的O原子和带正电的C原子形成-C=O，最终得到CAE。

图6 CAE合成反应机理Fig.6 The reaction mechanism of CAE

3 结论

本文合成了一种新型叶绿素类二氢卟吩衍生物132N-（2-羟乙基）-153N-（2-羟乙基）-173-甲氧羰基二氢卟吩e6-131-152-二酰胺（CAE）。通过合成工艺研究得出CAE的最佳合成条件为：n（Mpa）∶n（乙醇胺）=1∶5；反应时间2h；反应温度25℃。羟基的引入使水溶性大幅增加，弥补了传统光敏剂水溶性差的缺点。光谱学研究可知，CAE在662.5nm有一较强的紫外吸收峰，在669.5nm处有较强的荧光发射峰，吸光度和荧光强度均大于Mpa。CAE这种较强的紫外吸收能力和较高的荧光强度，使其具有作为新型光敏剂用于光动力治疗的潜力。本文还对CAE合成机理进行了研究，为以后类似物化合物的合成提供了理论基础。

［1］Pandey R K,Constantine S,Goff D A,Kozyrev A N,Dougherty T J, Smith K M.Chlorophyll-a Derivatives in photodynamic therapy effect of position of heptyl ether side-chains on in vivo photosensitizingactivity［J］.Bioorg.Med.Chem.Lett.,1996,6（1）:105-110.

［2］Pandey R K,Constantine S,Tsuchida T,Zheng G,Medforth C J, Aoudia M,Kozyrev A N,Rodgers M A J,Kato H,Smith K M, Dougherty T J.Synthesis,Photophysical Properties,in Vivo PhotosensitizingEfficacy,and Human SerumAlbumin BindingProperties of Some Novel Bacteriochlorins［J］.J.Med.Chem.,1997,40（17）: 2770-2779.

［3］Jinadasa R G W,Hu X K,Vicente M G H,Smith K M.Syntheses and Cellular Investigations of 173-,152-,and 131-Amino Acid DerivativesofChlorine6［J］.J.Med.Chem.,2011,54（21）:7464-7476.

［4］Liu K,Liu X M,Zeng Q H,Zhang Y L,Tu L P,Liu T,Kong X G, Wang Y G,Cao F,Lambrechts S A G,Aalders M C G,Zhang H. CovalentlyAssembled NIR Nanoplatformfor Simultaneous Fluorescence Imaging and Photodynamic Therapy of Cancer Cells［J］.Acs Nano,2012,6（5）:4054-4062.

［5］Stefflova K,Chen J,Marotta D,Li H,ZhengG,Photodynamic Therapy Agent with a Built-In Apoptosis Sensor for Evaluating Its Own TherapeuticOutcomeinSitu［J］.J.Med.Chem.，2006，49（13）：3850 -3856.

［6］Stefflova K,Chen J,Marotta D,Li H,ZhengG,Photodynamic Therapy Agent with a Built-In Apoptosis Sensor for Evaluating Its Own Therapeutic Outcome in Situ［J］.J.Med.Chem.,2006,49（13）:3850-3856.

［7］Li F Y,Na K.Self-Assembled Chlorin e6 Conjugated Chondroitin SulfateNanodrug forPhotodynamic Therapy［J］.Biomacromolecules, 2011,12（5）:1724-1730.

［8］Pandey R K,Shiau F Y,Sumiin A B,Dougherty T J,Smith K M. Structure/activity relationships among photosensitizers related to pheophorbides and bacteriopheophorbides［J］.Bioorg.Med.Chem. Lett.,1992,2（5）:491-496.

［9］Tamiaki H,Shibata R.,Mizoguchi T.The 17-Propionate Function of（Bacterio）chlorophylls:Biological Implication of Their Long Esterifying Chains in Photosynthetic Systems［J］.Photochem.Photobiol., 2007,83（1）:152-162.

［10］于沙沙,徐希森,刘洋,等.周环上芳基取代的叶绿素类二氢卟吩衍生物的合成［J］.有机化学,2014,34（2）:362-370.

［11］杨晓英,殷军港,金英学,等.（焦）脱镁叶绿酸-a的1,3-偶极环加成反应及其叶绿素类二氢卟吩的合成［J］.有机化学，2014, 34（11）:2279-2287.

［12］杨泽.叶绿素类二氢卟吩衍生物的化学修饰与合成［D］.烟台:烟台大学,2013.

［13］TsayJ M,Trzoss M,Shi LX,KongXX,Selke M,JungME,Weiss S.Singlet Oxygen Production by Peptide-Coated Quantum-Dot-PhotosensitizerConjugates［J］.J.Am.Chem.Soc.,2007,129（21）: 6865-6871.

Synthesis procedure and optical quality of 132-N-（2-hydroxyethyl）-153-N-（2-hydroxyethyl）-17-3-methoxycarbonyl-chlorin e6-13-1-15-2-diamide and optical quality*

ZHU Guo-hua，JIN Ying-xue*
（College of Chemistry&Chemical Engineering,Harbin Normal University,Harbin 150025,China）

On the basis of chlorophyll-a as starting material,a new chlorophyll chlorine derivative named 132-N-（2-hydroxyethyl）-153-N-（2-hydroxyethyl）-173-methoxycarbonylchlorine6-131-152-diamide（simple named CAE）was synthesized via a series of chemical reaction such as addition and substitution.The chemical structures of the unreported chlorin were characterized by UV-Vis,1H NMR,13C NMR and elemental analysis.We find the optimum conditions of the synthesisits by researching synthesis procedure of CAE.At the same time,optical quality and mechanism were also researched.

chlorophyll-a；chlorin；synthesis procedure；optical quality；reaction mechanism

O626.13

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20150401

2015-01-12

国家自然科学基金（No.21272048,21171045）；黑龙江省高校科技创新团队建设计划（No.2011TD010）资助项目

朱国华（1988-），男，陕西，在读硕士研究生，有机合成。

金英学（1966-），男，教授，博士，有机合成。