参萸明目合剂对糖尿病大鼠玻璃体及视网膜CTGF表达的影响

苏风军 韦企平 陆诗林 高 颖

参萸明目合剂对糖尿病大鼠玻璃体及视网膜CTGF表达的影响

苏风军1韦企平2陆诗林3高 颖2

目的探讨参萸明目合剂对糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）大鼠玻璃体结缔组织生长因子（CTGF）含量及视网膜CTGF表达的影响。方法用链脲佐菌素制备糖尿病模型。参萸明目合剂组给予参萸明目合剂，羟苯磺酸钙组给予羟苯磺酸钙灌胃，观察大鼠全身情况，称量体重、检测血糖、血脂和玻璃体CTGF含量及视网膜CTGF的表达，并进行视网膜切片免疫组织化学染色。结果参萸明目合剂可明显改善DR大鼠的生存状况，降低DR大鼠血糖、血脂并可降低大鼠玻璃体CTGF含量和视网膜CTGF的阳性表达，对实验性糖尿病视网膜病变有一定防治作用。结论参萸明目合剂能有效的保护大鼠视网膜微血管，降低毛细血管的通透性，防止视网膜病变向增殖期进展。

非增生型糖尿视网膜病变；参萸明目合剂；SD大鼠

结缔组织生长因子（CTGF）是一种新近发现的致纤维化因子。糖尿病性视网膜病变与视网膜成纤维细胞增生、组织纤维化密切相关。近年来的研究显示CTGF参与了糖尿病视网膜病变的发病机制，糖尿病视网膜病变患者玻璃体中该种因子含量随病程延长而增多〔1〕。由此我们推测糖尿病视网膜病变发展至后期成为增殖性糖尿病视网膜病变时，其纤维增殖膜的形成可能与CTGF相关，抑制CTGF的产生或表达，有益于控制糖尿病视网膜病变的发展。

1 材料与方法

1.1 糖尿病动物模型建立

由山东大学实验动物中心提供二级SD大鼠58只，均为雄性，体重250±10 g。经裂隙灯及直接检眼镜检查屈光间质清，眼底无异常者纳入实验。从中随机选取45只大鼠，禁食12 h后，将2%链脲佐菌素以60 mg/kg体重行一次性腹腔注射，48 h后测大鼠空腹血糖＞16.7 mmol/L，尿糖＞+++，为造模成功〔2〕。未造模的13只为空白对照组。

1.2 分组和实验方法

将45只糖尿病大鼠随机分为参萸明目合剂组15只，羟苯磺酸钙组15只，糖尿病模型组15只。空白组大鼠13只。实验过程中糖尿病模型组死亡3只，故实际观察糖尿病模型组大鼠12只。参萸明目合剂组以参萸明目合剂药液0.5 g/kg·d（正常成人剂量的20倍）〔3〕灌胃，每日1次，持续10周。羟苯磺酸钙组以羟苯磺酸钙药液0.5 g/kg·d（正常成人剂量的20倍）〔3〕灌胃，每日1次，持续10周。糖尿病模型组按给药组等量生理盐水灌胃，每日1次，持续10周。空白组正常喂养，自由饮水。

1.3 组织学处理

糖尿病大鼠造模成功10周时，以水合氯醛腹腔注射全身麻醉，每只大鼠取左眼，于颞上象限角膜缘后1.5 mm经睫状体平坦处用30 G注射器抽取0.03 ml玻璃体液，保存于-70℃，用酶联免疫吸附法检测其中CTGF含量。之后摘除眼球，以4%多聚甲醛固定，常规包埋制作石蜡切片，用酶联免疫吸附法检测视网膜CTGF含量。每只大鼠取右眼，摘除眼球，以10%中性福尔马林固定，行HE染色后观察视网膜结构。

1.4 检测指标

（1）检测造模成功时即治疗前及治疗4、6、8、10周血糖；检测治疗前及治疗10周后体重、三酰甘油、胆固醇、谷丙转氨酶、谷草转氨酶；检测治疗10周后24 h尿蛋白。（2）采用酶联免疫吸附法测定治疗10周后玻璃体CTGF含量。（3）采用免疫组化方法检测治疗10周后视网膜CTGF含量。（4）HE染色光镜观察治疗10周后视网膜结构。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 参萸明目合剂对糖尿病大鼠血糖代谢的影响

空白组大鼠的血糖值在各时间点保持正常而稳定。10周时糖尿病模型组、羟苯磺酸钙组、参萸明目合剂组血糖均高于空白对照组，差异有统计学意义（F=27.21，P＜0.05），羟苯磺酸钙组与糖尿病模型组差异无统计学意义（F=17.33，P＞0.05），参萸明目合剂组与糖尿病模型组差异有统计学意义（F=25.22，P＜0.05）。提示：参萸明目合剂可以降低糖尿病大鼠的血糖。各实验组大鼠血糖值在8周内呈进行性升高，10周时参萸明目合剂组血糖增加幅度低于羟苯磺酸钙组，差异有统计学意义（F=26.25，P＜0.001），提示参萸明目合剂对于降低糖尿病大鼠血糖有较好疗效（表1）。

2.2 参萸明目合剂对糖尿病大鼠体重增长的影响

治疗前后体重增加量空白组＞参萸明目合剂组＞羟苯磺酸钙组＞糖尿病模型组。各组间进行单因素方差分析显示：治疗前各组体重差异无统计学意义（P＞0.05），治疗后羟苯磺酸钙组、糖尿病模型组体重与空白组比较，差异均有统计学意义（P＜0.001），羟苯磺酸钙组和糖尿病模型组体重差异无统计学意义（P=0.54），参萸明目合剂组体重高于羟苯磺酸钙组及糖尿病模型组，差异有统计学意义（P＜0.001），提示参萸明目合剂可使糖尿病大鼠体重增长趋于正常（表2）。

表1 各组大鼠治疗前后血糖比较（±s，mmol/L）

表1 各组大鼠治疗前后血糖比较（±s，mmol/L）

注：10周时各组与空白组比较，F=27.21，P＜0.05；羟苯磺酸钙组与糖尿病模型组比较F=17.33，P＞0.05；参萸明目合剂组与糖尿病模型组比较，F=25.22，P＜0.05。

血糖值成模时4周6周8周10周空白组137.12±0.187.07±0.367.12±0.236.65±0.217.14±0.24糖尿病模型组1221.47±1.0723.28±0.8723.37±0.8224.56±0.3924.48±0.41羟苯磺酸钙组1521.93±0.7823.25±1.2523.80±0.5924.07±0.4624.15±0.69参萸明目合剂组1522.13±1.0923.40±0.9423.07±0.5623.20±0.5722.93±0.63组别样本数（只）

2.3 参萸明目合剂对糖尿病大鼠血脂代谢的影响

治疗前各组三酰甘油差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗后参萸明目合剂组、羟苯磺酸钙组和空白组之间差异无统计学意义（P＞0.05），上述三组甘油三酯均低于糖尿病模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），提示参萸明目合剂和羟苯磺酸钙对降低糖尿病大鼠三酰甘油有较好疗效。治疗前空白组总胆固醇低于各实验组，差异有统计学意义（P＜0.05），各实验组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗后羟苯磺酸钙组和糖尿病模型组差异无统计学意义（P＞0.05），参萸明目合剂组总胆固醇低于羟苯磺酸钙组及糖尿病模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），提示参萸明目合剂对降低糖尿病大鼠的总胆固醇有较好疗效（表3）。

表2 各组大鼠治疗前后体重比较（±s，g）

表2 各组大鼠治疗前后体重比较（±s，g）

注：组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用S-N-K法。同一列字母上标不同者比较，P＜0.05。组内比较采用配对t检验

组别样本数（只）治疗前治疗后tP空白组13251±5.51411±27.18a糖尿病模型组12252±4.71334±17.32b334.150.061羟苯磺酸钙组15254±3.12339±11.84b337.190.056参萸明目合剂组15251±4.55459±7.23c435.620.03 F 1.331175.296 P 0.275＜0.001

2.4 参萸明目合剂对糖尿病大鼠肝功能的影响

谷丙转氨酶（mmol/L）：羟苯磺酸钙组大鼠治疗前为55.62±6.79，治疗后56.69±4.91；参萸明目合剂组治疗前57.07±2.61，治疗后56.44±1.89。谷草转氨酶：羟苯磺酸钙组治疗前165.39±10.4，治疗后166.79±10.5；参萸明目合剂组治疗前163.57±8.87，治疗后166.71±8.98。经单因素方差分析，参萸明目合剂组与羟苯磺酸钙组大鼠治疗前后谷丙转氨酶及谷草转氨酶含量差异均无统计学意义（P＞0.05），提示参萸明目合剂和羟苯磺酸钙治疗期间对糖尿病大鼠肝功能均无明显损害。

2.5 参萸明目合剂对糖尿病大鼠24h尿蛋白的影响

24 h尿蛋白的测定（mg/24 h）：空白组6.33±0.45，糖尿病模型组42.93±2.43，羟苯磺酸钙组35.97±1.63，参萸明目合剂组33.92±1.32；经单因素方差分析，治疗10周后参萸明目合剂组和羟苯磺酸钙组大鼠24 h尿蛋白均低于糖尿病模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），参萸明目合剂组24 h尿蛋白低于羟苯磺酸钙组，差异有统计学意义（P＜0.05），提示参萸明目合剂和羟苯磺酸钙均有降低糖尿病大鼠尿蛋白的疗效，参萸明目合剂优于羟苯磺酸钙。

2.6 参萸明目合剂对糖尿病大鼠玻璃体CTGF含量的影响

各组大鼠玻璃体CTGF含量（pg/mL）：空白组211.54±7.27，糖尿病模型组474.25±7.29，羟苯磺酸钙组462.20±29.84，参萸明目合剂组353.73±8.17；经单因素方差分析，组间CTGF含量差异有统计学意义（P<0.05），t检验示：糖尿病模型组、羟苯磺酸钙组均较空白组CTGF含量升高，差异有统计学意义（P<0.05）。参萸明目合剂组较对照组CTGF含量差异有统计学意义（P<0.05），参萸明目合剂组优于羟苯磺酸钙组，表明参萸明目合剂能降低大鼠玻璃体CTGF含量，疗效优于羟苯磺酸钙组。

表3 各组大鼠治疗前后三酰甘油和总胆固醇比较±s，mmol/L）

表3 各组大鼠治疗前后三酰甘油和总胆固醇比较±s，mmol/L）

注：组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用S-N-K法。同一列字母上标不同者比较，P＜0.05。组内比较采用配对t检验

组别样本数（只）三酰甘油总胆固醇tP治疗前治疗后治疗前治疗后空白组130.79±0.110.83±0.92a0.810.071.35±0.211.48±0.09a1.380.060糖尿病模型组120.81±0.101.70±0.52b1.820.002.97±0.692.97±0.49b3.420.052羟苯磺酸钙组150.81±0.090.95±0.09a0.850.022.87±0.422.92±0.25b3.210.055参萸明目合剂组150.81±0.090.92±0.09a0.870.022.67±0.192.65±0.15c2.720.045 F 0.15230.8303.13182.731 P 0.928＜0.0010.080＜0.001 tP

2.7 各组大鼠视网膜免疫组化染色观察结果

治疗10周后空白组大鼠视网膜细胞排列整齐，各层组织无明显异常，神经节细胞层未见CTGF阳性表达细胞（图1）。糖尿病模型组视网膜细胞排列紊乱，神经节细胞层组织水肿，内、外核层细胞间明显水肿、疏松，细胞排列紊乱，CTGF表达呈强阳性，着染呈深棕色，视网膜明显水肿增厚（图2）。羟苯磺酸钙组视网膜细胞排列紊乱，神经节细胞层组织水肿减轻，内、外核层细胞间水肿、疏松，细胞排列紊乱，CTGF表达呈阳性，着染呈棕黄色，视网膜明显水肿增厚（图3）。参萸明目合剂组视网膜细胞排列较规则，神经节细胞层、内外核层组织水肿明显减轻，CTGF表达呈弱阳性，着染呈浅棕黄色（图4）。

2.8 各组大鼠视网膜HE染色光镜下观察结果

治疗10周后空白组大鼠视网膜结构完整，各层细胞清晰，细胞排列整齐（图5）。糖尿病模型组视网膜内表面不平整，内界膜肿胀明显，表面不平、增厚，有较多视网膜血管内皮细胞突出于内界膜。内外核层水肿，视网膜各层变薄，细胞数量减少且排列紊乱十分明显，部分血管明显扩张（图6）。羟苯磺酸钙组视网膜结构不规则，内界膜肿胀减轻，内外核层细胞水肿，排列紊乱，部分血管呈扩张趋势，但未见缺血区及新生血管形成（图7）。参萸明目合剂组视网膜轻微增厚，视网膜内界膜略肿胀，神经节细胞及内外核层细胞排列较整齐（图8）。

图1～4 治疗10周后各组大鼠视网膜免疫组织化学法CTGF染色光镜下观察结果（×400）。图1空白组大鼠视网膜细胞排列整齐，各层组织无明显异常，神经节细胞层未见CTGF阳性表达细胞。图2糖尿病模型组图视网膜细胞排列紊乱，神经节细胞层组织水肿，内、外核层细胞间明显水肿、疏松，细胞排列紊乱，CTGF表达呈强阳性，着染呈深棕色，视网膜明显水肿增厚。图3羟苯磺酸钙组视网膜细胞排列紊乱，内、外核层细胞间水肿、疏松，细胞排列紊乱，CTGF表达呈阳性，着染呈棕黄色，视网膜明显水肿增厚。图4参萸明目合剂组空白组视网膜细胞排列较规则，神经节细胞层、内外核层组织水肿明显减轻，CTGF表达呈弱阳性，着染呈浅棕黄色。

图5～8 治疗10周后各组大鼠HE染色光镜下观察结果（×400）。图5空白组大鼠视网膜结构完整，各层细胞清晰，细胞排列整齐。图6糖尿病模型组视网膜内界膜肿胀明显，有较多视网膜血管内皮细胞突出于内界膜。内外核层水肿，视网膜各层变薄，细胞数量减少且排列紊乱十分明显，部分血管明显扩张。图7羟苯磺酸钙组视网膜结构不规则，内外核层细胞水肿，排列紊乱，部分血管呈扩张趋势，但未见缺血区及新生血管形成。图8参萸明目合剂组视网膜轻微增厚，视网膜内界膜略肿胀，神经节细胞及内外核层细胞排列较整齐。

3 讨论

糖尿病视网膜病变是一种慢性进展性疾病，该病发展至后期将产生增殖膜，增殖膜的产生与其早期血管病变、各种细胞生长因子的作用密切相关，如不及时进行干预，随着病程延长，病情将加重，纤维化将发生〔4〕。

CTGF是一种新近发现的细胞因子，被视为转化生长因1（TGF1）的下游效应介质〔5〕，在创伤修复、组织纤维化进程中起重要作用。近期国外有人发现血管内皮生长因子和CTGF是PDR发生的2个最关键的因子〔6〕。正常生理情况下体内的CTGF表达很低或无。但在病理状况下，如进行性系统性硬化症、动脉粥样硬化、肿瘤、糖尿病、器官纤维化、创伤等情况下，成纤维细胞、内皮细胞等多种细胞均可产生CTGF。CTGF在DR发生的前期对视网膜病变的发生发展均具有一定的促进作用。国外研究发现DR患者玻璃体中CTGF浓度升高，导致新生血管形成更活跃〔7〕。CTGF促进新生血管形成及纤维化的机制可能与促进细胞有丝分裂和增生，趋化细胞、诱导细胞粘附以及促进细胞外基质合成有关〔8〕。CTGF在PDR的发生过程中起着一定的促进作用，可能与促进眼新生血管形成及纤维化有关〔9〕。

本研究中，各组大鼠视网膜HE染色及CTGF免疫组化染色结果显示：正常大鼠视网膜细胞排列整齐，各层组织无明显异常，神经节细胞层未见CTGF阳性细胞；糖尿病大鼠视网膜明显水肿，CTGF表达呈强阳性；参萸明目合剂组CTGF的阳性表达及视网膜水肿情况明显好于羟苯磺酸钙组和糖尿病模型组。各组大鼠玻璃体CTGF含量测定结果显示：生理状态下玻璃体内存在一定量的CTGF，糖尿病大鼠玻璃体CTGF含量明显增高，参萸明目合剂组明显低于羟苯磺酸钙组和糖尿病模型组。研究结果提示，随着糖尿病视网膜病变的进展，玻璃体CTGF含量和视网膜CTGF的阳性表达呈上升趋势，与国内同类研究一致〔1〕；而参萸明目合剂可降低玻璃体CTGF含量和视网膜CTGF的阳性表达，并延缓视网膜病变的进展。尽管CTGF并非DR发展过程中唯一的致纤维化因素，但其作用不容忽视，参萸明目合剂可抑制CTGF的阳性表达，对延缓DR病情发展，抑制PDR发生有较好疗效。其机理可能与抑制细胞有丝分裂和增生，抑制DR新生血管的形成和纤维化有关。同时，参萸明目合剂对糖尿病大鼠视网膜具有保护作用，可减轻视网膜各层水肿，阻断视网膜新生血管生长，维持视网膜结构整齐，减轻糖尿病对视网膜的损害。其作用机理可能与参萸明目合剂补益脾肾、活血通络，可改善视网膜的营养和微循环及减轻视网膜的缺血、缺氧状态有关。

本研究还观察到参萸明目合剂可降低血糖和血脂。参萸明目合剂能改善患者眼底，提高视力，考虑与其降血脂、降血糖的功效分不开。另外，参萸明目合剂能降低糖尿病大鼠尿蛋白，疗效优于羟苯磺酸钙〔10〕。参萸明目合剂可以减少早期糖尿病肾病大鼠尿蛋白的排泄，延缓糖尿病肾病的进展。同时，如果用药剂量合理，参萸明目合剂对大鼠肝功能无损害。

综上所述，参萸明目合剂能够抑制糖尿病大鼠视网膜CTGF表达，降低玻璃体CTGF含量，维持视网膜结构的正常，延缓视网膜新生血管生长及视网膜纤维化的发生；同时，参萸明目合剂能降低血糖、血脂、尿蛋白，维持大鼠的体重，对糖尿病肾病及DR的发展起到抑制作用，有较好的临床应用前景。

［1］Hinton DR，Spee C，He S，et al.Accumulation of NH2-terminal fragment of connective tissue growth factor in the vitreous of patients with proliferative diabetic retinopathy［J］.Diabetics Care，2004，2（7）：758-764.

［2］张洁.实验性糖尿病大鼠建模常用方法［J］.临床与医疗，2011，1（21）：395.

［3］郑虎占，董泽宏，佘靖.中药现代研究与应用（第一卷）［M］.北京：学苑出版社，I997，3680-3717.

［4］胡艳滨，张静楷，孙智勇，等．辛伐他汀对糖尿病大鼠玻璃体及视网膜结缔组织生长因子表达的影响［J］.中华眼科杂志，2012，48（5）：444-449.

［5］GrotendorstGR，OkochiH，HayashiN.Anovel transforming growth factor beta response element controlsthe expressionof the connective tissuegrowthfactorgene［J］.CellGrowthDiffe，1996，7（4）：469-480.

［6］Kita T，Hata Y，Kano K，et al.Transforming growthfactor beta 2 and connective tissue growthfactor inproliferative vitreoretinal disease spossible involvement of hyalocytes and the rapeutic potentialof rhokinase inhibitor［J］.Diabetes，2007，56（1）：231-238.

［7］HintonDR，Spee C，He S，et al.Accumulation of NH（2）-terminal fragment of connective tissue growth factor in the vitreous of patients with proliferative diabetic retinopathy［J］.Diabetes Care，2004，27（3）：758-764.

［8］Yokoi H，Sugawara A，Mukoyama M.Role of connective tissue growth factor in profibrotic action of transforming growth factor：a potential target for preventing renal fibrosis［J］.Am J Kidney Dis，2001，38（4）：134-138.

［9］丁纯.糖尿病视网膜病变玻璃体中CTGF，SDF-1的质量浓度测定［J］.国际眼科杂志，2010，10（7）：1314-1315.

［10］董静，梁翠格，于桂娜，等.羟苯磺酸钙治疗早期糖尿病肾病的疗效观察［J］.山东大学学报，2008，46（1）：80.

Effect of Shenyu Mingmu Heji on expression of CTGF in vitreous and retina of diabetic rats

SHUFengjun，WEI Qiping，LU Shilin，et al.Liaocheng City Hospital of Traditional Chinese Medicine，Liaocheng 252004，Shandong，China

OBJECTIVE To investigate the influence of Shenyu Mingmu Heji on diabetic retinopathy（DR）rats vitreous CTGF content and the expression of retinal CTGF and the mechanism of action.METHODS Used streptozotocin induced diabetic model.The treatment group was given Shenyu Mingmu Heji，the control group was given calcium dobesilate orally to observe the general expression of rats，weighing，blood glucose，lipid and CTGF in vitreous and retinal CTGF content and conduct immunohistochemical staining and retinal slice.RESULTS Shenyu Mingmu Heji could obviously improve the DR rat survival condition.This medicine could reduce the blood sugar and blood lipid of DR rats，reduce the content of vitreous and the positive expression of retinal CTGF.There was a certain preventive effect on experimental diabetic retinopathy.CONCLUSIONS Shenyu Mingmu Heji could protect the retina effective microvascular，reduce capillary permeability，prevent retinopathy progressed to proliferative phase.

non-proliferative diabetic retinopathy；Shenyu Mingmu Heji；SD rats

R285

A

1002-4379（2015）05-0318-05

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2015.05.003

1山东省聊城市中医医院眼科，聊城252004

2北京中医药大学东方医院眼科

3聊城市第三人民医院眼科

韦企平，Email：wei_dfyy@163.com