柚皮素缓解小鼠金黄色葡萄球菌肺炎的损伤作用及其机制

吴文伟 郑世翔 翁钦永 陈冬梅 (福建医科大学附属协和医院重症医学科，福建 福州 35000)

金黄色葡萄球菌肺炎临床上主要表现为支气管脓性分泌物增多、寒战、高热、呼吸困难等症状〔1〕。据调查统计，金黄色葡萄球菌肺炎占肺炎的2% ～3%，尤其是儿童、年老体弱者发病率较高。研究发现〔2〕，柚皮素能够改善金黄色葡萄球菌肺炎病情，本文通过观察柚皮素治疗金黄色葡萄球菌肺炎小鼠的情况，探讨其作用机制。

1 资料与方法

1.1实验动物 健康成年清洁级雄性C57BL/6J小鼠90只，体重18～25 g，购自上海斯莱克实验动物生产有限公司。采用抽签法随机分为对照组、模型组以及干预组，每组30只。实验操作严格依据中国科学技术委员会提出的《实验动物管理条例》进行。各组实验动物的体重、饲养方式、鼠龄无显著性差异(P＞0.05)。

1.2主要试剂及仪器 柚皮素(购自中国药品生物制品检定所);金黄色葡萄球菌8325-4菌(购自爱尔兰学院);小鼠白细胞介素(IL)-6、IL-1β以及肿瘤坏死因子(TNF)-α的ELISA试剂盒(购自Biolegend有限公司);立式压力蒸汽灭菌器、恒温培养箱、电子天平、紫外可见分光光度计、光学显微镜、低温高速离心机均由福建医科大学附属协和医院中心实验室提供。

1.3制备模型 雄性的C57BL/6J小鼠，体重18～25 g，均饲养于干净的代谢笼中，每日给予充足的水源以及标准实验室内动物饲料，室内环境控制在12/12 h黑白交替，温度控制在20℃ ～25℃，湿度控制在55% ～60%范围内。小鼠1 w适应后建立金黄色葡萄球菌肺炎模型。将金黄色葡萄球菌8325-4菌液15 μl经模型组及干预组小鼠鼻孔缓慢滴入小鼠鼻腔内。

1.4方法 随机选取已造模的C57BL/6J小鼠60只，随机分为模型组和干预组，每组30只。另外随机选取正常C57BL/6J小鼠30只作为对照组。干预组小鼠给予柚皮素100 mg/kg，1次/12 h，皮下注射。2 d后，运用颈椎脱臼方法处死小鼠，每组取10只小鼠，对肺内菌落进行计数;每组取10只小鼠，处理肺脏组织制作成病理切片，进行病理学研究;每组取10只小鼠，对细胞因子IL-6、IL-1β以及TNF-α进行测定。

1.5检测方法

1.5.1菌落计数 在实验2 d后对每组10只小鼠颈椎脱臼处死，在无菌操作下取出肺脏，称重、组织匀浆、稀释，固定于培养基表层，恒温箱培养24 h后显微镜下进行菌落计数。

1.5.2病理学观察 在实验2 d后对每组10只小鼠颈椎脱臼处死，在无菌操作下取出肺脏，制作组织切片，光学显微镜下观察病理情况，并进行采集图像。

1.5.3IL-6、IL-1β以及TNF-α测定 在实验2 d后对每组10只小鼠颈椎脱臼处死，运用ELISA方法对肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β 以及 TNF-α 进行测定，用 IL-6、IL-1β 以及 TNF-α ELISA试剂盒。

1.6统计学方法 应用SPSS19.0软件进行t检验。

2结果

2.1菌落计数 2 d后，模型组(5.9×106CFUs/mg)与干预组(2.3×104CFUs/mg)肺内菌落计数较对照组(1.0×102CFUs/mg)均有所增加(P＜0.05);与模型组比较，干预组肺内菌落计数均有所改善(P＜0.05)。

2.2病理学观察 HE染色后观察到，对照组中肺内组织结构完整，肺泡边缘整齐，肺泡腔内无异常;金色葡萄球菌8325-4肺炎模型组中的肺内组织结构模糊，无法识别，大量细菌弥漫在整个肺内，无肺泡结构，部分炎性细胞破裂坏死，细支气管上皮细胞部分坏死，其腔内有大量的炎性细胞，同时血管周围水肿，并有纤维组织渗出;柚皮素干预组小鼠肺内组织中，部分肺泡腔融合，肺泡壁毛细血管呈现略有扩张、少量的充血以及炎性细胞的浸润。见图1。

图1 三组肺脏病理改变(HE，×400)

2.3各组IL-6、IL-1β以及TNF-α水平测定 2 d后，模型组与干预组IL-6、IL-1β以及 TNF-α均有所增加(P＜0.05);与模型组比较，干预组IL-6、IL-1β以及TNF-α均有所改善(P＜0.05)。见表1。

表1 各组小鼠IL-6、IL-1β以及TNF-α水平(s，pg/ml，n=10)

表1 各组小鼠IL-6、IL-1β以及TNF-α水平(s，pg/ml，n=10)

与对照组比较:1)P＜0.05;与模型组比较:2)P＜0.05

组别 IL-6 IL-1β TNF-α干预组 284.82±21.541)2) 80.23±12.361)2) 125.75±14.371)2)模型组 785.69±50.311) 289.33±26.361) 384.74±26.181)对照组134.25±25.36 46.36±8.23 51.36±9.75

3讨论

金黄色葡萄球菌肺炎是肺炎中较重的一种，具有较高的死亡率和发病率〔3〕。而金黄色葡萄球菌主要致病力取决于外毒素，这些外毒素协助金黄色葡萄球菌侵入宿主〔4〕。α-溶血素就是其中主要的一种外毒素，是影响金黄色葡萄球菌致病力中主要的一种，特别是在肺炎的发病机制中必不可少。柚皮素是柚皮甙的甙元，属于二氢黄酮类化合物，具有抗菌、抗炎、清除自由基、抗氧化等功能〔5〕。本实验结果提示柚皮素对金黄色葡萄球菌肺炎有很好的抗菌作用，能够抑制金黄色葡萄球菌的繁殖，对肺炎具有一定的疗效。病理学改变提示柚皮素对金黄色葡萄球菌肺炎的肺内组织具有很好的保护作用，可能其机制与抑制α-溶血素有关〔6～9〕，从而阻止金黄色葡萄球菌的侵袭。并且柚皮素对于金黄色葡萄球菌肺炎小鼠肺泡灌液相关的细胞因子具有一定的改善作用。

柚皮素可显著减少金葡菌肺炎感染小鼠肺组织中菌落数目，能够明显缓解金黄色葡萄球菌肺炎炎症，值得推广。

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