冷鲜肉中新霉素残留快速检测法的研究

鲍会梅

（江苏食品药品职业技术学院食品与营养工程学院，江苏淮安223003）

冷鲜肉中新霉素残留快速检测法的研究

鲍会梅

（江苏食品药品职业技术学院食品与营养工程学院，江苏淮安223003）

建立高效液相色谱法检测冷鲜肉中新霉素残留量的方法，以甲醇含0.09mol/L三乙胺和0.45 mol/L磷酸为流动相，流速1.0 mL/min，柱温35℃，进样10 μL，在260、315 nm波长出检测。外标法定量的方法检出值为0.035 mg/kg，在添加水平为50 ng/g～250 ng/g范围内的平均回收率为81.98%～84.89%。表明该方法适用于冷鲜肉中新霉素残留的定量分析。

冷鲜肉；新霉素；快速检测；高效液相色谱法

新霉素属氨基糖苷类抗生素药物，对革兰氏阴性菌有极好的抑制作用，广泛应用于医药和兽药领域。在兽医临床上，新霉素是治疗畜禽细菌性肠炎的首选药物之一，但是新霉素吸收毒性大，其毒副作用主要表现为耳毒性和肾毒性，残留物对人体健康危害较大。随着新霉素在国内外畜牧养殖业中越来越广泛地应用，它在动物体内产生残留的问题也日益严重。世界上多个国家和组织限制肌肉组织中新霉素的最大残留量，中国、欧盟、日本公布最大残留限量是0.5 mg/kg，美国规定的新霉素残留量最大限量是1.2 mg/kg［1］。

有关新霉素含量测定的化学方法报道很多，这些方法主要是用来测定药物制剂中的新霉素含量，很少被应用到生物材料中。用于测定生物材料中新霉素残留的方法主要有微生物法，高效液相色谱法（HPLC），酶联免疫测定法（ELISA）。HPLC是目前应用最广泛的测定激素的方法［2］，它可分析热稳定性差的、沸点高、摩尔质量大的有机物，具有选择性高、快速、相对比较简单等特点。采用高效液相色谱法，通过对样液的提取以及衍生化条件的优化，建立对冷鲜肉中新霉素残留的快速检测的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试剂：乙脂、甲醇、三乙胺、磷酸、氯化钠（以上均为色谱纯）、混合提取液、洗脱液、邻苯二甲醛试剂；冷鲜肉：双汇，天玛特超级市场采购。

1.2 标准储备液溶液的配制

精密称取硫酸新霉素标准品14.10 mg，用去离子水定容至10 mL，得到浓度为1 mg/mL的标准储备液.倒入棕色瓶中，置于-18℃保存，按实验需求加以稀释。

1.3 主要仪器

液相色谱仪（配有荧光检测器）：上海精密科学仪器有限公司；高速捣碎机：上海科兴商贸有限公司；振荡器：巩义市英峪予华仪器厂；离心机：上海精密实验设备有限公司；阳离子交换柱：瑞士TECAN Genios。

1.4 方法

1.4.1 色谱选择

色谱柱为 Waters Atlantis C18色谱柱 ；Waters-2475荧光检测器的激发波长和发射波长分别为260、315 nm；流动相为77.5%甲醇水溶液含0.09 mol/L三乙胺和0.45 mol/L磷酸；流速1.0 mL/min；柱温35℃；进样10 μL。

1.4.2 样品处理及萃取

取一定量的冷鲜肉于高速捣碎机中捣碎，备用。

称取经处理后的试样约10.0 g于100 mL锥形瓶中，加入60 mL混合提取液和2 g氯化钠，震荡30 min，经过滤为80 μm～120 μm的过滤漏斗抽滤，残渣用混合洗涤液洗涤。合并滤液与洗液于250 mL烧杯中。在沸水下加热30 min，取下，于3 000 r/min离心20 min，置于4℃冰箱中冷却200 min。然后经滤孔40 μm～80 μm的过滤过滤漏斗抽滤，收集滤液待衍生化。

1.4.3 衍生化

将滤液注入阳离子交换柱中，用10 mL水洗柱，弃去流出液。将1 mL邻苯二甲醛试剂注入柱中，反应5 min，然后加2 mL洗脱剂洗脱柱上衍生物。弃去前面1 mL洗脱液，收集后面1 mL洗脱液，立即放置-18℃冰箱中，15 min后进行液相色谱测定。

1.4.4 工作曲线

取6个编号为1、2、3、4、5、6的10 mL比色管，分别加入新霉素标准使用液0、0.8、2、4、20、40 μL（浓度为0.00、0.08、0.20、0.40、2.00、4.00 μg/mL）。用去离子水定容到刻度，然后进行液相色谱测定，记录峰面积，以新霉素浓度为横坐标x，以峰面积为纵坐标y，绘制标准曲线图。

1.4.5 样品的检测

将收集的样品洗脱液稀释一定的浓度，使其浓度在线性范围内，上机检测峰面积，根据标准曲线查出新霉素浓度，再根据1.4.6公式计算出冷鲜肉中新霉素的残留量。

1.4.6 结果计算

按下面公式计算：

式中：X为新霉素残留量，（mg/kg）；A为样液中新霉素衍生物的峰面积，mm2；C为新霉素衍生物标准溶液中相当于硫酸新霉素浓度，（μg/mL）；V为最终样液的体积，mL；a为新霉素衍生物标准溶液中新霉素衍生物峰面积，mm2；m为最终样液相当的试样量，g；0.855为由硫酸新霉素换算成新霉素的换算系数。

1.4.7 样品提取的优化

1.4.7.1 提取液的选择

分析乙酰丙酮-甲醛、磷酸盐缓冲液-乙腈、磷酸盐-三氯乙酸溶液等对冷鲜肉中新霉素提取率的影响，得出最佳提取剂。

1.4.7.2 蛋白质沉淀剂的选择

称取经处理后的试样约10.0 g于100 mL锥形瓶中，加入60 mL混合提取液和分别加入三氯乙酸、氯化钠、盐酸各2 mL，所得提取液经邻苯二甲醛衍生化后，上机检测，比较回收率，确定最佳蛋白质沉淀剂。

1.4.7.3 提取液pH对试验影响

在最佳提取剂提取的样品溶液pH调至5.0、6.0、7.6、8.2、9.0、11.0，经衍生化后，上机检测，观察响应值的变化。

1.4.8 衍生化条件的优化

1.4.8.1 衍生化试剂浓度的确定

配制浓度为3.0、4.0、6.0、7.5、9.0、11.0、14.0 mol/mL的邻苯二甲醛溶液，取不同浓度的邻苯二甲醛溶液与新霉素溶液衍生15 min，上机检测。

1.4.8.2 衍生化时间的选择

将新霉素标准储备液稀释成1.0 mg/L，分别取1mL稀释液邻苯二甲醛溶液衍生4、7、10、13、15、17、20 min，分别上机检测。

1.4.8.3 衍生产物稳定性检测试验

将标准储备液稀释成1.0 mg/L，分别取1 mL稀释液邻苯二甲醛溶液衍生15 min，上机检测，每隔2小时检测一次。

1.4.9 检测条件的优化

1.4.9.1 淋洗液淋洗次数的优化

取10 g空白样品经过2.4.3后，加入100 μL的200 μL/mL的新霉素，用碱性缓冲液—甲醇（1+4）洗脱，分别洗脱4、5、6次，比较每次洗脱液中新霉素的回收率。

1.4.9.2 不同C18柱的选择

分别采用 CleanertC18、Waters Atlantis C18、AccubondIIC18进行检测，比较新霉素的回收率。

2 结果与分析

2.1 冷鲜肉中新霉素残留量的测定结果

2.1.1 标准曲线绘制

按试验方法绘制标准曲线，见表1和图1。

表1 数据记录Table 1 Data record

图1 新霉素标准曲线Fig.1 Neomycin standard curve

由图1可知，新霉素浓度在0.00 μg/mL～4.5 μg/mL范围内有良好的线性关系，求得的线性方程为Y=1 016.2x+1.580 4，R2=0.999 9。根据标准曲线可知冷鲜肉中新霉素含量的峰面积为387.0，代人2.4.6公式中，求得冷鲜肉中新霉素含量0.035mg/kg（国标0.02 mg/kg～0.5 mg/kg）。

2.1.2 精密度试验

分别取5份衍生化后的样液，在其他检测条件相同的情况下，运用上述方法进行多次检测，检测结果如表2所示。

表2 精密度实验Table 2 Precision experiment

通过对同一样品不同浓度的重复性实验对该测定方法的精密度进行检测，从表2可知，从样品批间变异系数和批内变异系数的数值比较，结果表明其检测重复性好，精密度较高，符合精密度好的要求。

2.1.3 回收率试验

在冷鲜肉的匀浆中添加一定体积的新霉素标准品溶液，使各组织中药物浓度分为50、100、250 ng/g进行添加回收实验，每个浓度做4个平行。结果见表3。

表3 样品添加回收实验Table 3 Sample addition recovery experiments

从表3中可以看出，冷鲜肉中新霉素的回收率为81.98%～84.89%。

因此，这种测定方法的精密度及准确度是可靠的，所以该方法是可行的。

2.2 样品提取的优化

2.2.1 提取剂的选择

在10 g的检样中各加60 mL乙酰丙酮-甲醛、磷酸盐缓冲液-乙腈、磷酸盐-三氯乙酸溶液等对冷鲜肉中新霉素进行提取。结果如表4。

表4 样品提取剂的提取率Table 4 Sample extraction agent and the extraction rate of

由表4可知，磷酸盐缓冲液-乙腈的提取率为93.2%，比乙酰丙酮-甲醛和磷酸盐-三氯乙酸提取率高。采用乙酰丙酮-甲醛和磷酸盐-三氯乙酸缓冲溶液作为提取剂，由于提取剂用量过少，样品匀浆黏度过大，吸附力增强，影响回收；如果提取剂过多，过柱时交换量降低，回收率也低。而本文采用磷酸盐缓冲液-乙腈溶液作提取剂，提取后加热，不但除去了蛋白质还可以挥发掉乙腈，减少了溶剂的体积，提高了柱的交换量，回收率也相应提高。因此，本文提取剂最佳选择是磷酸盐缓冲液-乙腈溶液。

2.2.2 蛋白质沉淀剂的选择

称取经处理后的试样约10.0 g于100 mL锥形瓶中，加入60 mL混合提取液和分别加入三氯乙酸、氯化钠、盐酸各2 mL，所得提取液经邻苯二甲醛衍生化后，上机检测，结果见表5。

表5 样品提取液的辅助剂的比较Table 5 Comparison of auxiliary agent liquid extraction sample

由表5看出，氯化钠做样品提取液辅助剂的回收率最高，三氯乙酸和盐酸的酸度高不适宜样液衍生化，而氯化钠属中性物质，可抑制蛋白质以及其产物对新霉素的吸附，大大的提高了新霉素的回收率，保证了实验的准确性及精密性。因此，氯化钠是最佳的样液提取剂的辅助剂。

2.2.3 提取液pH对试验影响

在磷酸盐缓冲液-乙腈提取的样品溶液pH调至5.0、6.0、7.6、8.2、9.0、11.0，经衍生化后，上机检测，观察响应值的变化。结果如表6所示。

表6 提取液pH对试验影响Table 6 Effect of 3-6 extract on experimental pH

由表6可知，提取液pH10.5，检测器响应值最大。以及样品在碱性环境中比较容易进行。由此，提取液最佳pH是10.5。

2.3 衍生化条件的优化

2.3.1 衍生化试剂浓度的确定

配制浓度为3.0、4.0、6.0、7.5、9.0、11.0、14.0 mol/mL的邻苯二甲醛溶液，取不同浓度的邻苯二甲醛溶液与新霉素溶液衍生15 min，上机检测。结果如表7和图2。

表7 衍生化试剂测定表Table 7 Derivatization reagent for measuring meter

图2 衍生化试剂测定Fig.2 Derivatization reagent for determination of

结果如表7和图2显示，衍生化试剂邻苯二甲醛在0～7 mol/mL左右，随着浓度的升高，样品的回收率也随之增高，当邻苯二甲醛浓度达到8（mol/mL）之后，回收率趋于平稳，综上所述，在试验中衍生化试剂邻苯二甲醛的最佳浓度为7.6 mol/mL。

2.3.2 衍生化时间的选择

将新霉素标准储备液稀释成1.0 mg/L，分别取1mL稀释液与邻苯二甲醛溶液衍生1、3、5、7、9、15 min，分别上机检测。结果如图3表8所示。

图3 衍生化时间选择图Fig.3 Derivatization Time Selection Chart

结果从图3表8可以看出，刚开始随着衍生时间的延长，被检样品的响应值逐渐增高，当衍生5 min后，检测器的响应值逐渐下降趋于平稳，由此可知，衍生化最佳时间是5 min，能使待检样品响应值最大，检测的灵敏度越高。

表8 衍生化时间选择表Table 8 Derivatization time selection table

2.3.3 衍生产物稳定性检测试验

将新霉素标准储备液稀释成1.0mg/L，分别取1mL稀释液与邻苯二甲醛溶液衍生15 min，上机检测，每隔2小时检测一次。结果表9。

表9 衍生化产物稳定性检测表Table 9 Derivatization product stability testing table

从表9可知，从检测开始曲线趋于平缓，响应值较为稳定，但8h后，曲线大幅下降，衍生物在0h～8h之间较为稳定，8h后变性。由此表明，在检测过程中避免衍生物变质，应控制在8h内检测完毕，以保证结果的准确性。

2.4 检测条件的优化

2.4.1 淋洗液淋洗次数的优化

取10 g空白样品经过1.4.3后，加入100 μL的200 μL/mL的新霉素，用碱性缓冲液—甲醇（1+4）洗脱，分别洗脱4、5、6次，洗脱液中新霉素的回收率如图4。

图4 不同淋洗次数下的回收率Fig.4 Recovery rate under different leaching times

从图4可以看出，当淋洗液淋洗到第五次时，此时响应值很高，回收率也在90%以上，达到检测的要求。如果淋洗次数过多，会影响衍生化试剂的衍生效力，同时影响淋洗液的pH，从而影响检测的准确性。本实验最佳淋洗次数为5次。

2.4.2 C18柱的选择

分别采用CleanertC18、Waters Atlantis C18、AccubondIIC18进行检测，新霉素的回收率如表10。

表10 不同C18柱比较表Table 10 Different C18column comparison table

如表10可知，CleanertC18、AccubondIIC18回收率分别为87.88%、80.32%，Waters Atlantis C18的回收率为99.12%，由此可知，Waters Atlantis C18的回收率最高，因此，Waters Atlantis C18柱是本实验的最佳选择。

3 结论与讨论

建立高效液相色谱法测定冷鲜肉中新霉素残留量。最终得到以下结论：以75.5%甲醇溶液含0.09mol/L三乙胺和0.45 mol/L磷酸为流动相，流速1.0 mL/min，柱温35℃，进样10 μL，在260、315 nm波长出检测。外标法定量的方法检出值为0.035 mg/kg，在添加水平为50 ng/g～250 ng/g范围内的平均回收率为81.98%～84.89%。由于新霉素没有发光基团，检测前必须经过对样品衍生化。通过对样品提取及衍生化条件的优化，得到样品的最佳提取溶剂是磷酸盐缓冲液-乙腈，在pH7.6时检测的灵敏度最强。确定衍生化试剂邻苯二甲醛在7.5 mol/mL的浓度下衍生效果最佳，衍生时间控制在15 min最佳，衍生产物的稳定性能持续8 h。通过本实验表明：该方法灵敏、可靠，准确度和精密度良好，前处理过程简单易行，便于操作，大大提高了样品的检测效率，且检测限低，适用于冷鲜肉新霉素残留量的检测。

［1］FAO/WHO，in：Residues of Some Veterinary Drugs in Animalsand Foods，Monographs Prepared by the 52nd Meeting of theJoint FAO/ WHO Expert Committee on Food Additives［R］.Rome，1999，133

［2］陈壬荃，陈桂良，新霉素及其他氨基糖苷类抗生素的分光光度快速测定［J］.中国医药工业杂志，1994，25（2）：79

Cold Meat Neomycin Residues Rapid Detection Method Research

BAO Hui-mei

（Jiangsu food vocational technical college of engineering food and nutrition，Huai'an 223003，Jiangsu，China）

This paper established a hig h-performance liquid chromatography assay for the detection of cold fresh meat of neomycin residues in method，with methanol containing three 0.09 mol/L and 0.45 mol/L phosphoric acid as mobile phase，flow rate of 1.0 mL/min，column temperature was 35℃，sampling 10 μL，in 260，315 nm wavelength detection.External standard method for quantitative detection value was 0.035 mg/kg，in addition level as 50 ng/g～250 ng/g range the average recovery rate was 81.98%～84.89%.Show that the method is suitable for the quantitative analysis of neomycin residue in chilled meat.

chilled meat；neomycin；rapid detection；high performance liquid chromatography

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.04.030

2014-11-12

鲍会梅（1974—），女（汉），副教授，硕士，研究方向：食品检测。