龙须菜寡糖发酵液的脱色工艺优化

王润萍，高超，产竹华，曾润颖，*

（1.宁波大学海洋学院，浙江宁波315211；2.国家海洋局第三海洋研究所，福建厦门361005）

龙须菜寡糖发酵液的脱色工艺优化

王润萍1，高超2，产竹华2，曾润颖2，*

（1.宁波大学海洋学院，浙江宁波315211；2.国家海洋局第三海洋研究所，福建厦门361005）

为提高龙须菜寡糖的纯度，采用糖用活性炭作为脱色剂对龙须菜发酵液的脱色条件进行了探索。首先通过单因素试验考察了脱色时间、温度、震荡转速、活性炭用量等条件对龙须菜发酵液脱色效果的影响。其次通过正交试验得出，糖用活性炭用量浓度为0.4 g/100 mL，脱色时间30 min，脱色温度25℃，震荡速200 r/min等条件下可获得脱色率85.57%，寡糖回收率92.68%。在脱色率较高的同时保证了寡糖的得率，取得了良好的脱色效果。

寡糖；正交试验；糖回收率；活性炭；脱色率

寡糖（oligosacharides）根据其生物学功能不同，可将其分为普通寡糖和功能性寡糖两大类。普通寡糖可被动物消化吸收，产生能量，如麦芽糖；功能性寡糖可促进肠道有益菌（如双歧杆菌、乳酸菌）的增殖，有益于人和动物的健康，属于营养生理活性物质［1］。功能性寡糖分子结构多样具有多种生物活性包括：抗肿瘤作用、降血糖血脂、抗自由基氧化、提高机体免疫力等生物活性；而且在农业方面有抑菌、促进生长活性［2］。

前期从西太平洋“暖池”区沉积物中分离得到一株可直接降解龙须菜产海藻寡糖的深海菌株Flammeovirga sp.Wpaga001。该菌可在接种量5.0%（体积分数）、37℃条件下降解3.0%（质量分数）龙须菜，获得寡糖含量3.83 g/L的发酵液［3］。层析分析所得寡糖聚合度为2-6的低聚糖，主要为琼胶二糖、三糖、四糖和六糖组成。水溶性好，有利于吸收，大大提高了其应用价值，是一种新型的海洋功能性寡糖［4］。通过实验表明该海藻寡糖有多种生理活性，具有抗氧化、清除自由基、促生长、抑菌活性、保鲜活性等［5］，其应用前景广泛。由于龙须菜藻体含有叶绿素和藻红素［6-7］，色素的存在使得龙须菜寡糖发酵液经过膜除菌后仍有较深的颜色，影响寡糖的色泽度；同时残留的色素对寡糖的生物活性功能造成影响，为其进一步利用带来困难，影响最终产品的质量，因此需要对龙须菜寡糖的发酵液进行脱色处理。

肖志刚等［8］对果寡糖的活性炭脱色工艺进行了研究，在活性炭用量1.2%，pH4.6，脱色时间40 min，脱色温度70℃条件下脱色率为96.95%；王成福等［9］通过优化颗粒活性炭对木糖液脱色可达到70%的脱色率；郭欣然等［10］对D-核糖的活性炭脱色优化得出在pH3.5，温度为50℃，间歇使用活性炭脱色30 min脱色率达80%以上。目前国内对于糖用活性炭进行龙须菜寡糖发酵液脱色工艺研究甚少。本试验通过正交试验优化了糖用活性炭对龙须菜发酵液的脱色条件，综合考虑脱色率和糖回收率，为龙须菜寡糖这一海洋资源的进一步研究、开发利用提供重要参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

龙须菜寡糖：宁波大学海洋学院实验室自制；糖用活性炭：广东达豪精细化学品公司；其他所用试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

SKY-2102恒温培养振荡器：上海苏坤实业有限公司；Innova-4340培养摇床：英国Innova公司；METTLERAE240电子分析天平：瑞士Mettler公司；Sping-S15 i+纯水器：RO-DI公司；磨粉机：广州旭朗机械设备有限公司；B.BARU.B发酵罐型5 L标准发酵罐：德国贝朗公司；RON-150A电热鼓风干燥箱：上海三腾有限公司；CHB-202恒温金属浴：杭州博日有限公司。

1.3 方法

1.3.1 单因素试验

1.3.1.1 时间和活性炭添加量对脱色的影响

各取20 mL的发酵液，分别加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 g/100 mL活性炭，每组3个平行。30℃、pH自然，100 r/min摇床震荡脱色，分别在20、40、60、80 min时各取1 mL脱色液，12 000 r/min离心8 min。取上清，分别测脱色液的吸光度，计算脱色率；测还原糖含量，计算脱色液中还原糖回收率。

1.3.1.2 温度对脱色的影响

各取20mL的发酵液，加入0.4g/100mL活性炭，pH自然，分别在20、30、40、50、60℃不同温度下200 r/min振荡脱色，每组3个平行。30 min各取1 mL脱色液，8 min、12 000 r/min离心取上清。分别测脱色液的吸光度，计算脱色率。测还原糖含量，计算脱色液的还原糖回收率。

1.3.1.3 振荡转速对脱色的影响

各取20 mL的发酵液，加入0.4 g/100 mL活性炭，置于30℃摇床中。分别设置静置、50、100、150、200 r/min进行脱色，每组各3个平行。30 min各取1 mL脱色液。8 min，12 000 r/min离心，取上清。分别测脱色液的吸光值、计算脱色率，测脱色液中还原糖含量、计算还原糖回收率。

1.3.2 正交试验优化龙须菜寡糖的脱色

分别以脱色率和还原糖的回收率作为考察指标，采用L9（33）正交试验［11］确定最佳脱色参数，各因素水平见表1。

表1 正交试验设计的因素和水平Table 1 Factors and levels for orthogonal experimental design

1.3.3 还原糖含量的测定

DNS法［12］：寡糖发酵液与DNS以1/3（v/v）比例混合，在沸水中煮沸15 min，冷却离心，取上清。分光光度计550 nm处测溶液的吸光值A0。

1.3.4 脱色效果计算

式中：A1为寡糖发酵液在脱色前的OD420；A2为寡糖发酵液脱色后的OD420。

还原糖回收率/%=（脱色后寡糖发酵液还原糖质量浓度-脱色前寡糖发酵液中还原糖质量浓度）/脱色前寡糖发酵中还原糖质量浓度×100

2 结果与讨论

2.1 时间和活性炭用量对脱色效果影响

根据实验结果得出最佳脱色时间40 min、活性炭用量0.6 g/100 mL。随着活性炭用量增加脱色率明显增加，见表2。活性炭用量与还原糖的剩余量呈负相关。脱色时间相同，随着活性炭用量增加，提取液中还原糖回收率减小。当活性炭用量为2 g/100 mL时，还原糖剩余量只有14%～18%，见表3。

脱色时间对于脱色率没有明显影响，脱色40 min时糖回收率最高。结果见表2、表3。

表2 时间和活性炭用量对脱色率影响Table 2 Effect of time and dosage of activated carbon on decoloration rate

表3 活性炭用量和时间对糖回收率影响Table 3 Effect of activated carbon dosage and time on sugar recovery rate

活性炭是一种多孔物质，主要靠这些孔吸附糖液色素和其他物质。活性炭用量越多，吸附能力越强，但活性炭吸附属于物理过程，其多孔吸附是有一定的饱和量［14-15］，过度增加活性炭用量不仅对脱色没有明显的效果，反而增加了生产成本不利于实际生产。其次，活性炭的动态性物理吸附过程，具有吸附与解吸双向性，色素和寡糖在活性炭上形成了竞争吸附导致色素解吸。脱色时间太长寡糖会氧化，发酵液颜色加深使得脱色率和糖回收率均降低［16］。因此，综合考虑脱色率和糖回收率，尽可能降低生产成本、节约能量，选取活性炭用量0.6 g/100 mL，脱色时间40 min。

2.2 温度对脱色效果影响

根据实验结果得出，脱色温度在20℃～30℃之间时，脱色率增长；在40℃时较低70.30%；40℃～60℃时脱色率基本不变。还原糖的回收率在脱色时间为20℃～30℃之间增长明显，30℃时糖回收率最高91%。结果见表4。

表4 温度对脱色效果的影响Table 4 Effect of temperature on the decolorization

活性炭的物理吸附在低温下即可达到最大吸附量，但会增加吸附时间。而温度过高，会造成活性炭吸附和解析的动态过程，而且由于分子热运动加快使得寡糖分子吸附在活性炭表面，糖回收率下降［17］。因此，根据的实际条件并且为了节约能源，最佳脱色温度30℃。

2.3 转速对发酵液脱色效果影响

根据实验结果，震荡转速越高脱色率越高，转速200r/min时脱色率最高99.76%，糖回收率较高74.8%。转速为0的情况下，糖回收率最高，但是脱色率最低。因此，选取最佳震荡转速200 r/min对其他条件进行优化。结果见表5。

表5 震荡转速对脱色效果的影响Table 5 Effect of shock speed on the decolorization

2.4 脱色率的正交试验结果

以脱色率和寡糖回收率为参考指标，采用综合加权评分法［18］进行考察，权重系数为0.5，分别把两项中最大的指标定为100分，按综合评分=（脱色率/79.64%）× 100×0.5+（还原糖剩余率/95.64%）×100×0.5计算。正交试验结果见表6，分差分析见表7。

表6 正交试验脱色率和糖回收率结果Table 6 Results of decoloration rate and sugar recovery rate by the orthotropic experiment

表7 方差分析表Table 7 Analysis of variance for the results of

根据实验结果表明，影响龙须菜寡糖发酵液活性炭脱色效果的因素重要性顺序为A＞C＞B，即时间＞活性炭用量＞温度。时间对于活性炭脱色效果影响最大，是整个脱色流程的重要点；其次为活性炭用量，最后是温度。对各因素进行直观分析，A因素（时间）：K1＞K3＞K2；B因素（温度）：K1＞K2＞K3；C因素（活性炭用量）：K2＞K1＞K3。由表7方差分析结果可见，A因素个水平间的差异有显著性（P＜0.05）因此，在考虑实际生产成本和脱色效果而确定龙须菜寡糖发酵活性炭脱色工艺的最佳条件为A1B1C2，即脱色时间30 min，温度25℃，活性炭用量0.6 g/100 mL。

2.5 优化的工艺条件试验验证

随机平行取已制备的发酵液3份，设置温度为25℃，加入活性炭0.4 g/100 mL，脱色30 min，转速200 r/min。计算脱色后龙须菜发酵液的脱色率和还原糖回收率。在此条件下，发酵液脱色率为85.57%，还原糖回收率为92.68%。与正交试验结果相符，确定该工艺条件合理可行，是最优的脱色工艺条件。

3 结论与讨论

糖用活性炭对寡糖液进行脱色，具有成本低、反应条件温和、不影响产品本身的生物活性等特点［19］，且活性炭安全无毒、可重复利用［20］，适合工业化生产的要求。本实验通过单因素试验结果发现，发酵液脱色率的增加会使得寡糖剩余量减少。因此，只有在保证较高的糖回收率的前提下进行脱色才有意义。通过正交试验，对龙须菜发酵液脱色的温度、时间、活性炭用量等条件进行了优化，得出脱色时间30 min，温度25℃，活性炭用量0.6%的脱色条件，此条件下脱色率高且还原糖损失率小。脱色后的寡糖纯度提高，杂质对其色泽及生物活性等的影响大为减小，为龙须菜寡糖的进一步工业化生产提供了支持，增加了龙须菜产业链的附加值。

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Optimization of the Decolorizing Process for Gracilaria lemaneiformis Oligosaccharide

WANG Run-ping1，GAO Chao2，CHAN Zhu-hua2，ZENG Run-ying2，*
（1.Shool of Marine Sciences，Ningbo University，Ningbo 315211，Zhejiang，China；2.Third Institute of Oceanography，SOA，Xiamen 361005，Fujian，China）

To improve the oligosaccharide purity from Gracilaria lemaneiformis，the decoloring conditions was studied by carboraffin which was used as the decoloring agent.First，through testing the optimal conditions of fermentation liquid from Gracilaria lemaneiformis，The decolorization time，temperature，agitation speed and activated carbon were investigated.Second，through the orthogonal experiment results，the optimal decoloration conditions were as follows：active carbon 0.4 g/mL，decolorating time 30 min，decolorating temperature 25℃，and agitation speed of 200 r/min.Under this condition，the decoloration rate was 85.57%and the recovery rate of oligosaccharide was 92.68%.We got a good decolorizing result with the higher decoloration rate and the oligosaccharide yield.

oligosaccharides；orthogonaltest；recoveryrateofoligosaccharide；activecarbon；decolorationrate

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.04.025

2013-12-27

海洋公益性行业科研专项（201105027）；厦门市科技局项目（3502Z20122010）

王润萍（1987—），女（汉），硕士研究生，研究方向：海洋生物资源利用。