大孔树脂对马鞭草总黄酮纯化工艺条件优化

李先佳，任丽平，常陆林

（漯河医学高等专科学校，河南漯河462002）

大孔树脂对马鞭草总黄酮纯化工艺条件优化

李先佳，任丽平，常陆林

（漯河医学高等专科学校，河南漯河462002）

选择7种不同型号大孔树脂，比较其对马鞭草总黄酮的吸附量和解吸率，筛选出AB-8为最佳吸附剂，其最佳动态吸附条件：上柱液浓度2.82 mg/mL，上柱流速为2 BV/h，pH为4.6。最佳洗脱条件：4 BV的75%乙醇浓度洗脱，洗脱流速控制在2 BV/h。结果表明：AB-8树脂对马鞭草总黄酮具有良好的吸附和解吸效果。

大孔树脂；马鞭草；黄酮；吸附；解吸

马鞭草系马鞭草科（Verbenaceae）植物马鞭草（Verbena officinalis L）的全草或带根全草。味苦性凉，入肝、脾、肾经，具有清热解毒、活血散淤及利水消肿的功能［1］，马鞭草主要成分有黄酮类、三萜类、甾体类、糖类等［2］。近年来关于马鞭草总黄酮的提取工艺和黄酮苷元的含量测定等方面报道较多［3］，但对总黄酮的富集纯化方面报道较少。本文就大孔树脂对马鞭草总黄酮纯化工艺进行了研究，为马鞭草资源的开发利用研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

马鞭草：采自河南鲁山，经漯河医专药学系赵喜兰副教授鉴定为Verbena officinalis L全草，60℃烘干，粉碎后过60目筛，备用。

标准品芦丁：中国药品生物制品检定所；其他试剂均为分析纯；D101型大孔树脂：沧州宝恩化工有限公司；D4020型大孔树脂：上海试剂一厂；树脂（AB-8，NKA-9，S-8，D3520，H1020）：南开大学化工厂。

1.2 仪器与设备

R-220旋转蒸发仪：瑞士步其公司；TU-1810紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；AE240型电子天平：瑞士梅特勒-托利多公司；真空干燥箱：上海一恒实验仪器总厂。

1.3 方法

1.3.1 大孔树脂预处理

树脂采用95%乙醇充分浸泡24 h，分别用乙醇和去离子水洗涤至不呈白色浑浊为止。再分别用5% HCl和2%NaOH溶液浸洗，去离子水洗至中性，备用。

1.3.2 提取液的制备

取马鞭草药材100 g，以料液比1∶10（g/mL）加入70%乙醇1 L，回流提取3次，每次提取2.5 h，提取液滤过，合并，减压回收乙醇，浓缩至无乙醇味，再用蒸馏水溶解制成不同浓度的溶液滤液，待用。

1.3.3 马鞭草中总黄酮含量的测定

采用芦丁为标准样品，参照文献［4］的方法绘制标准曲线，计算得回归方程为C=0.197 8A-0.02 9，r= 0.999 4，其中C为标准溶液浓度，A为芦丁在510 nm处吸光度值。结果表明芦丁浓度0.016 g/L～0.16 g/L范围与吸光度值线性关系良好。并根据该方法测定马鞭草提取液中总黄酮的含量，以芦丁的等价物表示。

1.3.4 大孔吸附树脂对马鞭草中总黄酮的静态吸附实验

1.3.4.1 大孔吸附树脂的吸附量测定

量取预处理的树脂D101，D4020，AB-8，NKA-9，S-8，D3520，H1020型大孔树脂各4 g于100 mL锥形瓶中，精确加入0.63 mg/mL样品溶液50 mL，恒温水浴摇床上振荡（90 r/min）吸附24 h，过滤，测定滤液中剩余的总黄酮含量，计算各种树脂的静态吸附量 ［Q（mg/g），Q=（C0-Cr）×V/M，C0起始浓度，（mg/mL）；Cr吸附后浓度，（mg/mL）；V为样液体积，mL；W为树脂质量，g］［5］。

1.3.4.2 大孔吸附树脂的解吸率测定

取1.3.3.1方法得到的饱和树脂，分别置于100 mL锥形瓶中，加入75%乙醇50 mL，恒温水浴摇床上振荡（90 r/min）解吸24 h，过滤，测定平衡液中黄酮类含量，计算静态解吸率［A（%），A=（C×V）×100%/（M×Q），式中：C为解吸液中总黄酮质量浓度，（mg/mL）；V为解吸液体积，mL；M为树脂质量，g；Q为吸附率，（mg/g）］［6］。

1.3.4.3 大孔吸附树脂的静态吸附动力学特性测定

量取预处理的树脂各4 g于100 mL锥形瓶中，精确加入1.61 mg/mL样品溶液50 mL，恒温水浴摇床上振荡（90 r/min）吸附12 h，每隔1小时测吸附液总黄酮的含量，绘制静态吸附动力学曲线。

1.3.5 树脂动态吸附与解吸工艺参数研究

通过静态吸附实验，将筛选出的理想树脂湿法装入层析柱中，考察上柱液浓度、上样流速、上样液的pH、样液的pH对吸附效果的影响以及洗脱剂的洗脱剂乙醇浓度、洗脱剂体积、流速对洗脱效果的影响。

2 结果与分析

2.1 大孔树脂的筛选

2.1.1 不同树脂对马鞭草总黄酮的静态吸附和解吸实验

本实验测定D101，D4020，AB-8，NKA-9，S-8，D3520，H1020等7种树脂对马鞭草总黄酮的吸附率和解吸率，结果见表1。

一般而言，树脂的吸附效果与树脂极性、孔径、比表面积存在一定的关系。由表1显示，比表面积比较大的D101，D4020，AB-8的吸附率都超过81%，在这3种树脂中，D101和AB-8两种弱极性的树脂吸附效果最好，这与黄酮类化合物极性较弱，有利于弱极性或非极性树脂的吸附有关。AB-8树脂不仅吸附效果较好，而且解吸率最佳，为87.2%。综合分析，选择AB-8为最佳树脂。

表1 7种树脂静态吸附及解吸结果Table 1 Results of static adsorption and desorption of seven types of resin

2.1.2 静态吸附动力学特性测定

D101，D4020，AB-8，NKA-9，S-8，D3520，H1020等7种树脂的吸附动力学曲线如图1所示。

图1 树脂静态吸附动力学曲线Fig.1 Kinetic curves of the static adsorption of resin

图1显示，树脂吸附3 h后，树脂基本达到吸附平衡，显示这几种树脂对马鞭草总黄酮的吸附属于快速平衡型，3 h达到平衡，尤其AB-8树脂的吸附液中总黄酮浓度下降的速度比其他树脂快，说明AB-8树脂吸附效果更佳。因此，本实验选择AB-8为最佳树脂。

2.2 AB-8树脂对马鞭草总黄酮的动态吸附实验

2.2.1 上样液浓度的影响

AB-8大孔树脂湿法装柱，将浓度为5.65 mg/mL蒸馏水稀释配置成5.65、4.34、3.77、2.82、1.88、1.61、1.25、0.86、0.71、0.63、0.57 mg/mL等不同浓度的溶液，控制吸附流速为2 BV/h，进行动态吸附试验，结果如图2所示。

图2 上样液浓度对吸附量的影响Fig.2 Effect of sample concentration on adsorption capacity

由图2可知，AB-8树脂吸附量随浓度的增大而加大，但达到2.82 mg/mL浓度后，吸附量变化幅度不大。综合考虑选择2.82 mg/mL样品液上样。

2.2.2 上样速率的考察

将浓度为2.82 mg/mL的样液分别以1、2、3、4、5 BV/h流速进行动态吸附，考察不同流速对树脂的动态吸附效果，见图3。

图3 流速对吸附量的影响Fig.3 Effect of flow rate on adsorption capacity

由图3可以看出，伴随流速的增加，树脂的吸附量在减少，流速过慢时，吸附量增加，但循环周期延长。因此，综合考虑工作效率和吸附效果，控制流速2 BV/h较理想。

2.2.3 样液的pH的确定

用稀氨水和稀盐酸调节样液（2.82 mg/mL）pH为2.7、3.5、4.6、5.4、6.7上柱，流速2 BV/h，考察不同pH对树脂的动态吸附效果，见图4。

由图4可见，pH 4.6树脂吸附量最大，这可能是由于黄酮类化合物多为多羟基酚类化合物，呈弱酸性，因此酸性条件下吸附量最好。但如果pH过低，容易形成烊盐，不易被吸附。

2.2.4 上样液体积的考察

AB-8大孔树脂湿法装柱，将浓度为2.82 mg/mL样液以2 BV/h流速上样，每一个柱体收集1份，检测流出液中总黄酮的浓度，考察树脂动态吸附效果，见图5。

图4 pH对吸附量的影响Fig.4 Effect of pH on adsorption capacity

图5 马鞭草总黄酮泄露曲线Fig.5 Leak curve of total flavonoids From Verbena officinalis

由图5结果显示，上样体积＜5 BV时泄漏较少，＞5 BV时样液泄漏明显，体积达11 BV时，流出液的总黄酮浓度与上样液接近，此时树脂已基本吸附饱和。

2.3 动态洗脱实验

2.3.1 洗脱剂乙醇浓度的确定

AB-8大孔树脂湿法装柱，2.82 mg/mL的上样药液调pH为4.6上样流速为2 BV/h，上样液后，依次采用2BV的去离子水，35%、45%、55%、65%、75%、85%、95%乙醇梯度洗脱，洗脱流速2 BV/h，考察不同浓度的乙醇的解吸率，洗脱液和上样液同时蒸干，得各部分洗脱液浸膏和上样液浸膏，见图6。

图6 乙醇浓度对解吸率和浸膏得率的影响Fig.6 Influence of ethanol concentration on desorption rate and extractum rate

从图6可以看出，当乙醇浓度达到75%时，解吸率和浸膏得率最高。这可能与解吸剂的极性相关，浓度小极性过大，浓度大则极性偏小，并影响解吸效果。

2.3.2 洗脱剂用量的确定

AB-8大孔树脂湿法装柱，pH为 4.6上样液（2.82 mg/mL）流速为2 BV/h上样，充分吸附，2 BV去离子水冲洗，75%乙醇以2 BV/h流速洗脱，洗脱剂用量以1 BV为收集单位，分段收集流出液，见图7。

图7 黄酮动态洗脱曲线Fig.7 The dynamic desorption curve of flavonoids

从图7可以看出，当洗脱量为4 BV时，树脂上的黄酮基本完全洗脱。故洗脱剂用量的确定为4 BV。

2.3.3 洗脱剂流速的确定

将浓度为2.82 mg/mL样液以2 BV/h流速通过树脂后，充分吸附，2 BV去离子水冲洗，4 BV的75%乙醇以1、2、3、4、5 BV/h的流速洗脱，考察洗脱剂流速对解吸的影响，见图8。

图8 洗脱剂流速对解吸率的影响Fig.8 Effect of eluant velocity on desorption rate

从图8可以看出，伴随流速的增加，黄酮的解吸率在减少，但流速过慢，循环周期延长。因此，综合考虑工作效率和吸附效果，控制流速2 BV/h较理想。

2.4 工艺验证

按上述优选工艺进行纯化试验，纯化后解吸液中总黄酮为232.14 mg，洗脱液和上样液同时蒸干称重分别为343.30 mg和1 327.84 mg，结果纯化前黄酮为282 mg，纯度为21.24%，纯化后黄酮的纯度为67.62%，精制倍数为67.62%/21.24%=3.18。

3 结论

7种树脂中，AB-8大孔树脂对马鞭草总黄酮的吸附量和解吸率较高，为快速平衡型，是纯化马鞭草总黄酮理想的树脂。

AB-8大孔树脂吸附马鞭草总黄酮的最佳工艺参数：上样药液浓度2.82 mg/mL，上样流速为2 BV/h，pH为4.6。解吸工艺参数：4 BV的75%乙醇浓度洗脱，洗脱流速控制在2 BV/h。

马鞭草提取液经过AB-8大孔树脂分离纯化后，马鞭草总黄酮的精制倍数为3.18。

［1］金伟军，张志东.马鞭草的研究进展［J］.时珍国医国药，2007，18（3）：693-694

［2］陈改敏，张建业，洪广峰.马鞭草中总黄酮的含量测定［J］.中国现代应用药学杂志，2006，23（8）：798-799

［3］黄锁义，罗建华，刘娇，等.超声波提取马鞭草总黄酮及鉴别［J］.时珍国医国药，2007，18（6）：1464-1465

［4］刘江波，傅婷婷，吕秀阳.大孔树脂分离纯化三叶青总黄酮的工艺研究［J］.中国药学杂志，2011，46（4）：287-292

［5］裴咏萍，李维林，张涵庆.大孔树脂对红凤菜总黄酮的吸附分离特性研究［J］.时珍国医国药，2010，21（1）：8-9

［6］孟兆青，丁岗，柳于介，等.异长春花苷内酰胺大孔树脂纯化研究［J］.中国中药杂志，2011，36（8）：1007-1010

Process Conditions of Purification of Total Flavonoids from Verbena Officinalis by Macroporous Resin

LI Xian-jia，REN Li-ping，CHANG Lu-lin
（Luohe Medical College，Luohe 462002，Henan，China）

Seven types of macroporous resin were selected to compare their performances in absorbing and desorbing flavonoids in Verbena officinalis.The macroporous resin AB-8 was chosen to be the best．The results indicated that the optimum condition：the extract concentration was 2.82 mg/mL，adsorption velocity was 2 BV/h，the pH was 4.6，the eluting reagent was 75%ethanol，the desorption rate was 4 BV/h．The dose of the reagent was 4 times as much as the column volume．The results showed that AB-8 resin could be used in separation an purification for total flavonoids of Verbena officinalis.

macroporous resin；Verbena officinalis；flavonoids；adsorption；desorption

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.04.019

2014-09-26

李先佳（1977—），男（汉），副教授，硕士，从事生物活性成分的分离与鉴定。