响应面法优化微波辅助提取艾草黄酮工艺

何义雁，张珺，朱香燕，吴卫国

（湖南农业大学食品科学技术学院，湖南长沙410128）

响应面法优化微波辅助提取艾草黄酮工艺

何义雁，张珺，朱香燕，吴卫国*

（湖南农业大学食品科学技术学院，湖南长沙410128）

以艾草为原料，通过单因素试验和响应面试验设计优化微波辅助提取黄酮工艺，分别考察了乙醇浓度、液料比、微波功率、微波时间对黄酮得率的影响。结果表明，最优工艺条件为：乙醇浓度72%、液料比45∶1（g/mL），微波功率520 W，微波时间151 s，在此工艺条件下，艾草黄酮得率为4.37%。

艾草；黄酮；微波；提取；响应面分析法

艾草，别名艾蒿、香艾、医草等，菊科多年生草本植物，具有独特的香味，营养丰富，药食兼用［1］。艾草可制成各种保健食品和食品配料［2-3］，国内已有企业将艾草开发成绿色食品［4］，出口日本，同时艾草还具有较高的药用价值［5-6］，在我国南方一些地区，常被用作为一种滋补药材。近来研究发现［7-8］：艾草中含有丰富的黄酮类化合物，具有降脂、降血压、抗血栓、抗肿瘤、抗氧化、增强免疫力、延缓衰老以及治疗慢性前列腺炎等多种生理活性功能。随着人们健康意识的不断增强，黄酮类化合物引起越来越多研究人员的重视，近年来，国内外特别重视黄酮类化合物作为食品添加剂的开发研制，已开发出添加有黄酮类化合物的饮料、面包、啤酒等［9］。艾草作为黄酮类物质的天然载体，具有广阔的开发前景。

传统的提取黄酮的方法提取率低、耗时长，相比于传统方法，微波萃取技术能缩短萃取时间和提高萃取效率，并且具有高选择性、低能耗、加热均匀等特点［10-11］。目前，国内对艾草黄酮的研究较多［12-13］，但采用响应面法优化微波提取艾草黄酮工艺的研究鲜有报道。本研究根据Box-Behnken试验设计原理进行响应面试验，优化了微波辅助提取艾草黄酮的工艺条件，为艾草黄酮的进一步开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 材料与试剂

新鲜艾草茎叶：采自湖南农业大学实验基地，采收于4月中旬，50℃热风干燥后粉碎过80目筛，放入磨口瓶中备用。芦丁标准品：中国食品药品检定研究所；氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠、95%乙醇、石油醚：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

WFJ-7200型可见分光光度计：龙尼柯仪器有限公司；TP-213型电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；NJL07-3型实验用微波炉：南京杰全微波设备有限公司；101A-3ET型电热鼓风干燥箱：上海沪粤明科学仪器有限公司；RE-52CS-1型旋转蒸发仪：上海洪纪仪器设备有限公司；SHB-ⅢT型循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；Q-100A2型高速多功能粉碎机：上海冰都电器有限公司。

式中：m1为按标准曲线方程计算出来的被测液中黄酮的含量，mg；m为艾草粉质量，g；V1为待测液体积，mL；V2为待测液总体积，mL。

1.3 试验设计

1.3.1 单因素影响试验

以0.5g艾草粉为提取对象，在固定乙醇浓度70%、液料比50∶1、微波功率500 W、微波时间120 s条件下的基础上，变动其中的一个因素，分别探讨其对黄酮得率的影响。单因素试验设计如下：

1）乙醇浓度设计：50%、60%、70%、80%、90%（体积比）等5个水平；

2）液料比设计：10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1（g/mL）等6个水平；

3）微波功率设计：300、400、500、600、700 W等5个水平；

4）微波时间设计：60、90、120、150、180、210、240 s等7个水平。

1.2 方法

1.2.1 芦丁标准曲线制作［14］

准确称取6.5 mg芦丁标准品，以80%乙醇定容至100mL，摇匀，既得芦丁标准溶液，浓度为0.065 mg/mL。准确吸取0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL芦丁标准溶液于25 mL容量瓶中，加30%乙醇补足至12.5 mL，加5% NaNO20.7 mL，摇匀并放置5 min，再加10%Al（NO3）30.7mL，摇匀并放置5min，最后加1mol/L NaOH 4.0mL，用30%乙醇定容至刻度，摇匀并放置15 min，在510 nm处测定吸光度。

1.2.2 艾草黄酮的制备

准确称取艾草粉0.5 g，置于萃取瓶中，按设计好的乙醇浓度、液料比、微波功率、微波时间进行微波提取。滤液用旋转蒸发仪减压浓缩去除乙醇，得到的提取液用石油醚去除叶绿素等脂类物质，再进行浓缩，最后用适量95%乙醇溶解，5 000 r/min条件下离心10 min，取上清液定容至100 mL，备用。

1.2.3 提取液中黄酮的测定

准确吸取1.2.2节中制备的提取液0.3 mL，按照标准曲线的方法测定吸光度，代入标准曲线方程，求出浓度，再按式（1）计算黄酮得率。

1.3.2 响应面试验设计

在单因素试验结果的基础上，以乙醇浓度、液料比、微波功率、微波时间为自变因素，以黄酮得率为响应值，按照Box-Behnken试验设计原理设计四因素三水平试验，采用Design Expert 8.0.6软件进行数据分析，试验因素和水平见表1。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Factors and levels in response surface analysis

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线方程

由1.2.1中方法可得到标准曲线方程：A=8.35714C+ 0.003 19（A表示吸光度，C表示浓度），R2=0.998 86。2.2 单因素试验结果与分析

2.2.1 乙醇浓度对黄酮得率的影响

试验考察了乙醇浓度对黄酮得率的影响，结果如图1所示。

图1 乙醇浓度对黄酮得率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of flavonoids

由图1可知，随着乙醇浓度（体积浓度）的增加，黄酮得率呈先上升后下降的趋势，在乙醇浓度为70%时达到最大值。当乙醇浓度大于70%时，黄酮得率反而下降，这可能是由于一些醇溶性物质、叶绿素的溶出增加，这些成分会减少黄酮类化合物同乙醇-水分子的结合，从而导致黄酮得率的减少［15］。

2.2.2 液料比对黄酮得率的影响

试验考察了液料比对黄酮得率的影响，结果如图2所示。

图2 液料比对黄酮得率的影响Fig.2 Effect of liquid to material ratio on the yield of flavonoids

由图2可知，随着液料比的增加，黄酮得率先上升后逐渐达到平衡。液料比从10∶1增加到40∶1时，得率的增幅较大，液料比继续增加，得率的增幅很小，逐渐趋于平衡。增加溶剂能够促进黄酮类物质的溶出，从而提高了黄酮的得率，但液料比太大，会造成溶剂的浪费。从提取效果和经济方面考虑，液料比选40∶1比较合适。

2.2.3 微波功率对黄酮得率的影响

试验考察了微波功率对黄酮得率的影响，结果如图3所示。

图3 微波功率对黄酮得率的影响Fig.3 Effect of microwave power on the yield of fla

由图3可知，随着微波功率的增加，黄酮得率呈现先上升后下降的趋势，当微波功率为500 W时，黄酮得率达到最大。这有可能是因为溶液分子之间的运动会随着微波功率的增加而变得更加剧烈，从而使细胞膜的破碎程度变大，黄酮类物质的浸出率增加，但是微波功率过高会使溶液的温度迅速升高而导致黄酮类化合物的分解，因此使得黄酮得率下降。

2.2.4 微波时间对黄酮得率的影响

试验考察了微波时间对黄酮得率的影响，结果如图4所示。

由图4可知，随着微波时间的增加，黄酮得率增加，当微波时间为150 s时，黄酮得率达到最大，继续增加微波时间，黄酮得率反而下降。这有可能是由于在较短的时间里微波对细胞膜的破坏程度较大，能够促进物质的溶出，因此得率也高，但是如果微波时间过长，高温对提取液中的有效成分有破坏作用，会使黄酮类化合物分解，并且高温能够使高分子杂质浸出量增加，影响提取物的有效含量［16］。

图4 微波时间对黄酮得率的影响Fig.4 Effect of microwave time on the yield of flavonoids

2.3 响应面试验设计与结果

2.3.1 试验设计及结果

在单因素试验结果的基础上，以乙醇浓度、液料比、微波功率和微波时间为自变因素，以黄酮得率为响应值，按照Box-Behnken试验设计原理设计四因素三水平试验，试验设计及结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.3.2 模型方程的建立及其方差分析

以黄酮得率为响应值，由Design Expert 8.0.6软件对试验数据进行分析，经回归拟合后，得到黄酮得率（Y）对乙醇浓度（A）、液料比（B）、微波功率（C）和微波时间（D）的多元回归方程为：Y=4.25+0.24A+0.22B+ 0.098C+0.067D-0.090AB-0.082AC+0.015AD+0.075BC-0.020BD-0.20CD-0.51A2-0.23B2-0.32C2-0.28D2

由表3的方差分析可得到，该模型达到极显著水平（P＜0.000 1）。并且，该模型的失拟度不显著（P＞0.1），可知该方程与实际数据拟合性良好，试验设计可靠，适用于微波辅助乙醇提取艾草黄酮工艺的优化。信噪比的值为57.753，远大于4，因此该模型可以用于预测试验数据。决定系数R2=0.9965，调整后R2=0.9931，从而说明该模型的变量与自变量之间关系显著。在此模型中，乙醇浓度、液料比、微波功率、微波时间对黄酮得率都有极显著的影响。且乙醇浓度与液料比、乙醇浓度与微波功率、液料比与微波功率、微波功率与微波时间之间的交互作用极显著。

表3 二次回归模型的方差分析结果Table 3 Analysis of variance for each item of the developed quadratic regression model

2.3.3 响应面及等高线图分析

对表3结果中交互作用显著的因素作响应曲面及等高线图，见图5、6、7、8。

各个因素对黄酮得率的影响能够从响应曲面图的形状反应出来，响应曲面越陡峭的因素对黄酮得率的影响就越显著［17］。比较图5、6、7、8并结合表3可以得出各因素对艾草黄酮得率影响大小依次是乙醇浓度＞液料比＞微波功率＞微波时间。

图5 乙醇浓度与液料比交互作用的响应面图Fig.5 Response surface of ethanol concentration and liquid to material ratio

图6 乙醇浓度与微波功率交互作用的响应面图Fig.6 Response surface of ethanol concentration and microwave power

图7 液料比与微波功率交互作用的响应面图Fig.7 Response surface of liquid to material ratio and microwave power

图8 微波功率与微波时间交互作用的响应面图Fig.8 Response surface of microwave power and microwave time

比较图5、6、7、8并结合表3可知，两因素交互作用由大到小为：微波功率和微波时间＞乙醇浓度和液料比＞乙醇浓度和微波功率＞液料比和微波功率。由图5可知，当乙醇浓度一定时，随着液料比的增加黄酮得率呈现先增加后趋于平缓的趋势；当液料比一定时，随着乙醇浓度的增加黄酮得率呈现先增加后减小的趋势；乙醇浓度和液料比的等高线趋于椭圆状，说明二者的交互作用显著。由图6可知，随着乙醇浓度和微波功率的增加黄酮得率呈现先增加后减小的趋势；乙醇浓度和微波功率的等高线趋于椭圆状，说明二者的交互作用显著。由图7可知，当液料比一定时，随着微波功率的增加黄酮得率呈现先增加后减小的趋势；当微波功率一定时，随着液料比的增加黄酮得率呈现先增加后趋于平缓的趋势；液料比和微波功率的等高线呈椭圆状，说明二者的交互作用显著。由图8可知，随着微波时间和微波功率的增加黄酮得率呈现先增加后减小的趋势；微波功率和微波时间的等高线呈椭圆状，说明二者的交互作用显著。

2.4 验证试验

利用Design Expert 8.0.6软件进行工艺参数的优化分析，可得艾草黄酮提取的最佳工艺条件为乙醇浓度71.77%、液料比44.66∶1、微波功率517.12 W、微波时间151.47 s，此时艾草黄酮得率预测值为4.34%。考虑到实际操作的可行性，将提取工艺条件调整为乙醇浓度72%、液料比45∶1、微波功率520 W、提取时间151 s，在此条件下进行3次重复验证实验，平均值为4.37%，与预测值相比，相对误差为0.69%。由此可知，试验结果与模型相符，说明通过响应面优化法得到的微波辅助提取艾草黄酮的工艺条件是可靠的。

3 结论

本实验采用微波辅助法对艾草中的黄酮进行提取，通过单因素和Box-Behnken响应面试验得到黄酮得率和乙醇浓度、液料比、微波功率、微波时间的回归模型，得到优化的工艺条件为：乙醇浓度71.77%、液料比44.66：1、微波功率517.12W、微波时间151.47s。其回归方程为：Y=4.25+0.24A+0.22B+0.098C+0.067D-0.090AB-0.082AC+0.015AD+0.075BC-0.020BD-0.20CD-0.51A2-0.23B2-0.32C2-0.28D2。结合实际可操作性调整最优工艺条件为：乙醇浓度72%、液料比45∶1、微波功率520 W、提取时间151 s，黄酮得率为4.37%，与理论预测值4.34%相比，其相对误差为0.69%，说明该模型能较好地模拟和预测艾草黄酮得率。通过方差分析可知，各因素对艾草黄酮得率影响大小依次是乙醇浓度＞液料比＞微波功率＞微波时间。由响应曲面图分析可知，乙醇浓度与液料比、乙醇浓度与微波功率、液料比与微波功率、微波功率与微波时间之间的交互作用对艾草黄酮得率的影响极显著。

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Optimization of Microwave-Assisted Extraction of Flavonoids from Artemisia Argyi by Response Surface Methodology

HE Yi-yan，ZHANG Jun，ZHU Xiang-yan，WU Wei-guo*
（Food Science and Technology College，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，Hunan，China）

Microwave-assisted extraction flavonoids from Artemisia argyi was investigated by examining the effects of ethanol concentration，liquid to material ratio，microwave power and microwave time on the yield of flavonoids，by using single factor method coupled with response surface experimental design.The result showed that ethanol concentration of 72%，liquid to material ratio of 45∶1，microwave power of 520 W and microwavetime of 151 s were found optimum.Under the optimized conditions，the yield of flavonoids was 4.37%.

Artemisia argyi；flavonoids；microwave；extraction；response surface methodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.04.018

2014-08-06

何义雁（1990—），女（汉），硕士，研究方向：食品资源开发与利用。

*通信作者