东海裸五角瓜参胶原蛋白提取及其性质研究

周光东，邓尚贵，俞晓雯，蔡林林

（浙江海洋学院 浙江舟山316000）

东海裸五角瓜参胶原蛋白提取及其性质研究

周光东，邓尚贵*，俞晓雯，蔡林林

（浙江海洋学院 浙江舟山316000）

本研究以舟山产裸五角瓜参为对象，研究了体壁组织的基本组成成分、酸溶与胃酶促溶胶原提取率、提取胶原蛋白特性以及其体外抗氧化性。结果表明：裸五角瓜参蛋白质含量较高，粗蛋白含量达到18.56%，且以胶原蛋白为主，该胶原蛋白经酸提法和酶提法处理后具有典型的水产品胶原蛋白特性，2%为NaCl最佳添加浓度；电泳实验表明该胶原蛋白的链和β链分子量分别为98 kU和102 kU；此外，两种胶原蛋白还具有一定的抗氧化性，但其抗氧化能力较弱。

裸五角瓜参（Pentacta inornata）；胶原蛋白；性质

裸五角瓜参（Pentacta inornata）属海参纲，光参科，广泛分布于我国东南沿海各省，尤以浙江境内产量最大，是一种常见的低值海参。长期以来，由于裸五角瓜参表皮坚硬，水发时间长，家庭条件难以烹调食用，造成这类丰富的海参资源长期得不到应有的开发利用，市场售价与经济价值背离［1］。尽管刺参肉质细嫩，已经成为海参消费市场的主流消费对象，但由于刺参的养殖规模目前已经不能得到有效增长，而市场对海参的需求逐年扩大，形成了光参得不到充分利用，而刺参又不能满足市场对海参的旺盛需求的局面。因此，深入研究光参基本特性，为其充分开发利用奠定基础成为这类资源实现高效利用的必然途径。本研究以此为背景，以舟山产裸五角瓜参为研究对象，研究其体壁组织的基本组成成分，酸溶与胃酶促溶胶原提取率、提取胶原蛋白特性以及其体外抗氧化性，以期为光参的高值化利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

裸五角瓜参，捕捞于舟山嵊泗海域，购于舟山国际水产城码头，要求原料鲜活。原料收购后立刻装入碎冰泡沫箱，1 h内运至实验室，保存于-55℃超低温冰箱，备用；原料经浙江海洋学院海洋科学学院赵盛龙教授鉴定为裸五角瓜参（Acaudina Molpadioides）；原料所需化学试剂、酶制剂及分子量标准品等均购于国药集团上海化学试剂有限公司，均为分析纯。

旋转蒸发仪（A-1000S）：日本东京理化；LGJ-10B冷冻干燥机：北京四环科学仪器厂；HZQ-F160A其恒温震荡培养箱：北京四环科学仪器厂；JZQ-Ⅱ均质器：天津东康科技有限公司；UV-2800紫外可见分光光度计：日本日立有限公司；其余均为实验室常用设备。

1.2 方法

1.2.1 预处理

原料从冰箱中取出后，流水解冻，剖腹，去除内脏，沥干，待用。

1.2.2 基本营养成分测定

水分、灰分、蛋白质、粗脂肪等常规营养成分测定参照国标法，胶原蛋白含量测定参照Visessanguan等方法［2］。

1.2.3 胶原蛋白酸性提取

胶原蛋白酸提法参考朱伟的方法［3］，具体操作为：将光参体壁剪碎，用0.1 mol/L的NaOH浸泡8 h，清洗至中性，再加入0.5 mol/L的乙酸溶液浸泡24 h，浸泡完毕后过滤、离心，除去不溶物；取上清液，缓慢加入一定量的固体NaCl，4℃下静置过夜后可见有白色絮状沉淀析出，即为胶原蛋白；上清液高速离心（10 000 r/min，30分钟）后得到酸溶性胶原蛋白，1 000D分子量透析膜清水中透析至中性后冷冻干燥，备用。

1.2.4 胶原蛋白酶解提取

酶法提取在参考刘成梅等方法基础上改用胃蛋白酶［4］。将酸提法中得到的不溶物收集后，按照酶=不溶物质质量比1∶1 000比例加入蛋白酶（酶活力30 000 U/g），而后加入不溶物总质量10倍的、pH为2的乙酸溶液，37℃保温2 h后100℃灭酶10 min，过滤，取滤液加入一定量的NaCl，剩余操作同酸提法。其中胶原蛋白溶出率/%=（获得的胶原蛋白/总胶原蛋白）*100，其中获得的胶原蛋白量为酸法提取和酶法提取量总和。

1.2.5 光参胶原蛋白紫外吸收光谱分析

精确称取10 mg光参胶原蛋白溶解于10 mL浓度为0.5 mol/L乙酸溶液中，于190 nm～400 nm波长范围内扫描，采用0.5 mol/L乙酸溶液为空白。

1.2.6 光参胶原蛋白电泳分析

精确称取胶原蛋白1 mg，溶解于0.5 mol/L乙酸溶液中，用0.01 mol/LNaOH调节至中性后加入缓冲液后置于沸水浴5 min，取出后8 000 r/min离心5 min，取适量上清液进行电泳，电泳条件为直流稳压电源，电流为15 mA，时间2 h～3 h；分离胶条件为：浓度20%分离胶：30%凝胶储备液3 mL，3 mol/L pH8.9的Tris-HCl缓冲液3 mL，10%SDS 0.1 mL，10%过硫酸铵0.1 mL， TEMED 0.006 mL，再加入重蒸水0.6 mL；浓度5%浓缩胶：30%凝胶储备液0.83 mL，0.5 mol/L，pH6.7的Tris-HCl缓冲液0.63 mL，10%SDS 0.5 mL，10%过硫酸铵0.05 mL，TEMED 0.005 mL，再加入重蒸水3.4 mL；电极缓冲液：Tris-甘氨酸缓冲液，pH8.3；样品缓冲液：0.02 mol/L磷酸缓冲液，pH7.2，内含1%SDS，0.02%溴酚蓝，20%甘油，1%巯基乙醇；染色液：0.25 g考马斯亮蓝R-250加入91 mL 50%甲醇，9 mL冰醋酸配制而成；脱色液：75 mL冰醋酸，875 mL重蒸水和50 mL甲醇混匀。

样品分子量从标准蛋白迁移率同其分子量对数标准曲线上计算获得。迁移率按下式计算：

迁移率Rf=样品移动距离（mm）/溴酚蓝移动距离（mm）

1.2.7 光参胶原蛋白抗氧化能力测定

光参胶原蛋白抗氧化能力测定采用DHHP法［5］，并参考Kumar等方法［6］，采用铁氰化钾法测定其还原能力。抗氧化能力测定中以等剂量VC做对照。

2 结果与分析

2.1 裸五角瓜参基本营养成分

裸五角瓜参基本营养成分见表1。

表1 裸五角瓜参基本营养成分Table 1 Bascial nutrition consitituation of sea cucumber %

表1为裸五角瓜参基本营养成分数据。从表中可以看出，瓜参水含量较高，同东风螺、牡蛎、管角螺等贝类水分含量接近［7］，而灰分含量较高，表明含有较为丰富的矿物元素，这可能是由瓜参生活海域所致。从表1还可以看出，裸五角瓜参中碳水化合物主要为多糖类物质，这也表明裸五角瓜参可能还有较多的生理活性物质。裸五角瓜参粗脂肪含量较低，而蛋白质含量较高，由此可见，裸五角瓜参是一类符合现代消费人群对食品中低脂要求的良好的蛋白质补充来源。

2.2 裸五角瓜参胶原蛋白紫外光谱分析

图1是裸五角瓜参酸溶胶原蛋白和胃蛋白酶溶胶原蛋白紫外吸收光谱图。

图1 裸五角瓜参酸溶胶原与胃酶促溶胶原紫外吸收光谱图Fig.1 UV absorption spectra of collagen of sea cucumber

通常由于蛋白质中的色氨酸、酪氨酸、脯氨酸和组氨酸都含有共轭双键，使得大多数蛋白质在280 nm处都有一个很强的紫外吸收，而在图1中的280 nm处并未出现吸收峰，表明该蛋白并非普通蛋白；由于胶原蛋白本身含有酪氨酸和苯丙氨酸，而这两种氨基酸具有敏感的发色团，对300 nm以下波长存在最大吸收，从图中可以看出，2种不同提取方式的胶原蛋白溶液在230 nm处均有最大吸收波峰，完全符合胶原蛋白的紫外吸收特性此外，在230 nm处出现最大吸收峰也可能是由于裸五角瓜参胶原蛋白的多肽链中含有C= O双键较多的氨基酸导致，其中天冬氨酸、精氨酸等都含有C=O双键。

2.3 加入的NaCl对胶原蛋白溶出的影响

图2是胶原蛋白上清液中加入不同浓度NaCl对胶原蛋白溶出率的影响。

图2 不同浓度NaCl对胶原蛋白溶出的影响Fig.2 Effect of different concentration of NaCl on dissolution rate of collogen

从图2中可以看出，两种提取方式所获得的胶原蛋白的溶出率同NaCl加入量呈负相关，NaCl加入越多，溶出率越低。其中酸提法NaCl浓度为1%和2%时胶原蛋白溶出率分别为98.87%和98.23%，而酶提法同浓度NaCl的溶出率分别为98.67%和98.12%，基本没有差别，而当NaCl加入量提高到3%时，胶原蛋白溶出率降低到80.23%和81.28%，因此确定两种提取方法中NaCl最佳用量为1%～2%。试验中发现，尽管1%的NaCl浓度的胶原蛋白溶出率最高，但当NaCl浓度为2%时有利于胃蛋白酶活力的稳定。因此确定2%为最佳NaCl添加浓度。

2.4 光参胶原蛋白电泳图谱

图3是裸五角瓜参胶原蛋白的电泳图谱。

图3 光参胶原蛋白电泳图谱Fig.3 Gel electrophoresis of sea cucumber collogen

从图3中可以看出，酶法和酸法提取的胶原蛋白分子量基本相同，其中酸法和酶法提取蛋白各获得3条较为清晰的电泳带，其中胶原蛋白的链分子量约为100 kU，而由于β链为α链的二聚体，则分子量约为200 kU，而γ链为α链的三聚体，理论上分子量约为300 kU。通过Maker迁移率可计算得到α链和β链分子量98 kU和102 kU，满足典型水产品胶原蛋白特性，但试验中并未发现γ链的泳带，这可能和分离胶浓度及电泳条件有关。此外，从图中还可以看出，除较为明显的α链和β链的泳带之外，还有若干条不太清晰的泳带，这可能与胶原蛋白含有部分蛋白杂质有关，表明酸提法和酶提法尽管具有较好的提取效果，但提取的胶原蛋白纯度仍需进一步提高。

2.5 裸五角瓜参胶原蛋白抗氧化特性

图4和图5分别是不同提取方式的胶原蛋白对DPPH自由基清除率和还原能力结果。

图4 不同浓度胶原蛋白对DPPH自由基的清除率Fig.4 Clearance of concentration of collogen on DPPH

图5 不同浓度胶原蛋白的还原能力Fig.5 Reducing capacity of concentration of collogen

从图4可以看出，2种提取方法得到的胶原蛋白在低浓度下（低于1.5%）对DPPH自由基的清除能力均显著低于VC；随着胶原蛋白浓度的提高，清除率也仅能达到等剂量VC的72%左右；从图5可以看出，胶原蛋白的还原能力较弱，最高浓度（2.5%）的胶原蛋白还原能力仅为VC的33.4%左右。此外，从图4和图5中可知，提取方式对两种胶原蛋白的抗氧化能力并没有太大影响，酸提法和酶提法得到的胶原蛋白抗氧化能力之间并没有显著差别。通常，抗氧化能力和还原力之间存在关联性，即一般来说还原能力越高，则抗氧化能力越强［8-9］。对于本试验提取的胶原蛋白而言，其抗氧化性表现出一定的不对称性，即胶原蛋白对DPPH自由基表现出一定的清除能力，但其还原性则较弱，其中原因有待进一步研究。

3 结论

裸五角瓜参蛋白质含量较高，粗蛋白含量达到18.56%，其中主要以胶原蛋白为主；紫外光谱分析结果也表明通过酸提法和酶提法获得的蛋白具有典型的胶原蛋白特性，在230 nm处具有典型的吸收峰；在酸提法和酶提法的基础上，改用加入固体NaCl以提高胶原蛋白提取率，结果表明，2%的NaCl胶原蛋白溶出率最高；电泳图谱表明所得的胶原蛋白具有典型的α链和β链，其分子量分别为98 kU和102 kU，但未分离得到γ链；抗氧化能力试验结果表明，两种胶原蛋白都具有一定抗氧化性，但抗氧化能力显著低于VC，且表现出一定的不对称性。

［1］霍健聪，邓尚贵，潘华芬.东海光参生物酶解软化工艺研究［J］.食品科技，2011，36（1）：34-38

［2］VISESSANGUAN W，BENJAKUL S，RIEBROY S，et al.Changes in composition and functional properties of proteins and their contributions to Nham characteristics［J］.Meat Science，2004，66（2）：579-588

［3］朱伟，张歆，黄山玲子.鱼鳞胶原蛋白提取及抗氧化活性初探［J］.食品科技，2012，37（10）：204-206，210

［4］刘成梅，梁汉萦，刘伟.罗非鱼鱼皮多肽（TSP-Ⅰ）抗氧化活性的研究［J］.食品研究与开发，2007，22（11）：148-151

［5］夏光华，申铉日，蔡锦红，等.三酶法制备罗非鱼鱼皮胶原蛋白抗氧化肽及活性研究［J］.食品科学，2012，33（23）：175-179

［6］Kumar S，Dhankhar S，Yadav S，et al.Evaluation of Antioxidant Activity of Stem and Root Extracts of Salvadora oleoides，a Medicinal Plant［J］.Journal of Herbs，Spices&Medicinal Plants，2014，20（2）：132-147

［7］迟淑艳，周歧存，周健斌，等.华南沿海5种养殖贝类营养成分的比较分析［J］.水产科学，2007，26（2）：79-83

［8］马利华，贺菊萍，泰卫东，等.槐花提取物抗氧化性能研究［J］.食品科学，2007，28（9）：75-77

［9］张红城，李慧岩，董捷，等.茶花花粉蛋白酶解物抗氧化性的研究［J］.食品科学，2007，28（8）：58-61

Extraction and Characterization Investigation of Collagen from Sea Cucumber（Pentacta inornata）

ZHOU Guang-dong，DENG Shang-gui*，YU Xiao-wen，CAI Lin-lin
（College of Food and medcicine，Zhejiang Ocean University，Zhoushan 316000，Zhejiang，China）

This paper investigated the components of squid skin，the type and characteristics of the collagen from sea cucumber（Pentacta inornata）.The results were as follows：content of crude protein was 16.43%，which was mainly collagen.The protein extracted from sea cucumber was typically the aquatic collagen after been tested by UV scanning.Concentration of 2%could get the highest dissolution rate.The electrophoresis classified collagen into two parties，and β，respectively，and which possessed molecular weight 98 kU and 102 kU.Furthmore，these two kinds of collagen had a certain antioxidative ability，but which was comparatively low compared to VC.

Pentacta inornata；collagen；character

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.04.012

2014-11-11

“十二五”国家科技支撑计划“水产品加工过程质量安全控制关键技术集成与示范”（2012BAD29B06）

周光东（1994—），男（汉），本科生，目前就读于浙江海洋学院食品科学与工程专业。

*通信作者：邓尚贵（1966—），男（汉），教授，博导，博士，主要从事水产品加工与贮藏。