乳糖诱导纤维二糖差向异构酶的表达及热处理纯化*

汪明明，杨瑞金，2，华霄，沈秋云，张文斌，赵伟

1(江南大学食品学院，江苏无锡，214122)

2(江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡，214122)

乳果糖(4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-果糖)是一种功能性低聚糖，目前被广泛用于便秘、血内毒素、肝性脑病等的临床治疗，也作为健康食品添加剂使用［1－2］。2011 年 Kim 等人研究发现，Caldicellulosiruptor saccharolyticus纤维二糖差向异构酶(CsCE)可以催化乳糖异构化生成乳果糖和依匹乳糖，乳果糖最高转化率达88%［3－4］，远高于传统 β-半乳糖苷酶的转化率(7.5% ～30%)［5］，甚至高于目前工业上化学法生产乳果糖的转化率(75% ～80%)［6］。作为目前酶法制备乳果糖中转化效率最高的酶，CsCE催化乳糖生产乳果糖有着广阔的工业化前景。

本实验室前期已成功构建CsCE的高效表达菌株E.coli BL21(DE3)。虽然极少量的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)即可诱导目的酶蛋白的表达，但是IPTG具有潜在的毒性，而且价格昂贵，同时IPTG不能被菌体代谢，后期去除困难，而乳糖无毒且廉价易得，在诱导产酶的同时还能作为碳源被菌体代谢利用，是工业上最有潜力替代 IPTG的诱导剂［7－8］。本实验首先使用乳糖替代IPTG诱导CsCE的表达，确定最佳诱导剂浓度、诱导时机、诱导温度以及诱导时间。乳糖诱导目的蛋白高效表达的同时也会生成杂蛋白，本实验根据CsCE的热稳定性，采取热处理工艺除去大部分的杂蛋白，大大简化了CsCE的分离纯化。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

CsCE高效表达菌株E.coli BL21(DE3)，由本实验室构建和保藏;卡那霉素、IPTG、丙烯酰胺(Acr)、甲叉双丙烯酰胺(Bis)，生工生物(上海)股份有限公司;低分子质量标准蛋白，大连宝生物工程有限公司;胰蛋白胨(Tryptone)、酵母提取物(Yeast Extract)，英国Oxoid公司;乳果糖标准品，Sigma公司;乳糖、NaCl等其他试剂均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。

发酵培养基(Luria-Bertani液体培养基，g/L):酵母提取物5、胰蛋白胨10、NaCl 10，调节pH 至7.0，用去离子水定容至1 L，121℃高压蒸汽灭菌20 min，摇瓶发酵均采用250 mL锥形瓶，装液量为50 mL的LB液体发酵培养基。

1.2 仪器与设备

高速冷冻离心机Sorvall Biofuge Primo R Centrifuge，美国Thermo Scientific公司;紫外可见分光光度计UV1100，上海美谱达仪器有限公司;超声破碎仪Vibra CellTM，美国Sonic＆Material公司;全自动高压灭菌锅CL-40M，日本ALP公司;蛋白电泳系统Power Pac Universal以及凝胶成像系统Gel Doc XR，美国Bio-Rad公司;高效液相色谱L-2000，日本Hitachi公司等。

1.3 实验方法

1.3.1 CsCE酶活测定

CSCE粗酶液制备:最适发酵条件下，取100 mL发酵液，4 ℃，10 000 r/min，20 min离心收集细胞，去离子水洗涤2次并重悬于10 mL pH 7.5 50 mol/L Tris-HCl缓冲液中，冰浴条件下超声破碎(5 s/5 s，10 min)，4 ℃，12 000 r/min离心20 min，收集上清液即为CsCE粗酶液。

CsCE酶活测定按照Kim等人所报道的方法［9］。酶活力单位定义:在酶活力测定条件下，1 min催化反应生成1 μmol乳果糖所需的酶量为1 U。

乳果糖含量的测定按照张中等所描述的方法［10－11］。

1.3.2 E.coli BL21(DE3)生长曲线的建立

采用比浊法测定E.coli BL21(DE3)生长曲线。具体步骤:取保存于－80℃甘油中的菌种，37℃，200 r/min活化培养12 h。然后按1%的体积比接菌量于50 mL(250 mL锥形瓶)含10 μg/mL卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，37℃，200 r/min摇瓶培养，以LB液体培养基为空白对照，每隔1 h测定OD600，以发酵时间为横坐标，以OD600为纵坐标，绘制E.coli BL21(DE3)生长曲线。

1.3.3 蛋白浓度测定

采用Bradford法测定蛋白质含量［12］。

1.3.4 菌体生物量的测定

采用比浊法(OD600)测定菌体生物量。

1.3.5 SDS-PAGE电泳分析

取 CsCE 粗酶液，经 SDS-PAGE［13］，Bio-Rad 凝胶成像扫描分析。

1.3.6 CsCE诱导表达条件的优化

最佳诱导浓度:大肠杆菌培养至对数前期OD600=0.6时，IPTG诱导组分别加入不同量的IPTG至终浓度为:0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L，乳糖诱导组加入不同量的乳糖至终浓度分别为:0.25、0.5、0.75、1.0、2.5、5.0、7.5、10、20 g/L，25℃，200 r/min继续培养16 h，取样测发酵液酶活。

最佳诱导时机:大肠杆菌分别培养至OD600=0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 时，不同的诱导组分别加入IPTG和乳糖至最适浓度，25℃，200 r/min继续培养16 h，取样测发酵液酶活。

最佳诱导温度:在最佳诱导时机下添加最适浓度的IPTG和乳糖至不同诱导组，分别在15、20、25、30、35℃下，200 r/min继续培养16 h，取样测发酵液酶活。

最佳诱导时间:在最佳诱导条件下，IPTG和乳糖诱导组分别在200 r/min下培养24 h，每隔2 h取样，取样测发酵液酶活。

1.3.7 IPTG及乳糖诱导CsCE表达效果比较

以IPTG和乳糖为诱导剂，分别在最适诱导条件下诱导CsCE的表达。分别取上清酶液测定发酵液酶活及可溶性蛋白质含量，同时通过SDS-PAGE电泳，分析目的蛋白含量，并测定发酵液菌体生物量OD600。

1.3.8 CsCE的酶学性质

CsCE最适反应pH:在不同pH条件下(其中pH 6.0 ～7.5，50 mmol/L PIPES;pH 7.5 ～9.0，50 mmol/L Tris-HCl)分别测定反应液中乳果糖含量，确定CsCE的最适反应pH。

CsCE最适反应温度:不同温度下(50～90℃)分别测定反应液中乳果糖含量，确定CsCE的最适反应温度。

CsCE 热稳定性:将酶液分别在 60、65、70、75、80、85℃下保持不同时间(0～12 h)，测定CsCE的残留酶活。

1.3.9 CsCE的热处理纯化

CsCE在80℃下的半衰期可达2 h，而大部分的杂蛋白在60℃以上的温度下很短的时间内就会发生变性沉淀，据此选择热处理的方法对乳糖诱导的CsCE发酵液进行纯化。

具体方法如下:乳糖诱导CsCE的粗酶液分别在60、65、70、75、80 ℃下保持不同时间(0 ～2 h)，4 ℃，12 000 r/min离心20 min取上清液，测定热处理后的残留酶活及可溶性蛋白质含量，同时通过SDS-PAGE电泳，分析目的蛋白含量。

2 结果与讨论

2.1 E.coli BL21(DE3)生长曲线

如图1所示，在0～1 h内，摇瓶发酵培养的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)处于生长延滞期，1～7 h处于对数生长期，8 h后进入稳定期。

2.2 CsCE诱导表达条件

2.2.1 IPTG诱导CsCE的表达

图2为IPTG诱导CsCE表达条件的优化。IPTG是目前摇瓶发酵中最常用的诱导剂，其本身不被菌体代谢，而且一般重组大肠杆菌对IPTG的诱导极为敏感，极少量的IPTG即可稳定诱导产生大量目的蛋白［14］。

从图2可知，随IPTG浓度的增加，发酵液酶活呈先升高后降低的趋势，这主要是由于较高浓度的IPTG会抑制细胞的生长［15］。在菌体生长的不同阶段加入IPTG均能有效诱导CsCE的表达，但当OD600大于0.6时，随着初始菌体生物量的增大，发酵液酶活增长趋势变缓，杂蛋白增多，比酶活逐渐下降。温度对CsCE的表达影响显著，较高的温度有利于菌体细胞的大量增殖，但低温则有利于目的蛋白的表达。随着发酵时间的延长，发酵液总酶活呈现先显著增加(0～14 h)，然后保持稳定(14～20 h)，最后逐渐降低(20～24 h)的变化趋势，同时随着发酵时间的延长，发酵液中菌体生物量增大，发酵液的比酶活会随之降低。综合考虑，选择在菌体培养至对数前期OD600=0.6时，加入IPTG至终浓度0.4 mmol/L，在25℃的条件下诱导14 h，在该条件下，发酵液的总酶活和比酶活均处于较高水平，诱导效率最高。

图1 E.coli BL21(DE3)的生长曲线Fig.1 Growth curve of E.coli BL21(DE3)

图2 IPTG对CsCE的诱导表达效果Fig.2 Optimal conditions of IPTG on the production of CsCE

2.2.2 乳糖诱导CsCE表达

图3为乳糖诱导CsCE表达条件的优化。由图3A可以看出，不同浓度的乳糖均能诱导CsCE的表达。在一定浓度范围内，随着乳糖浓度的增加，发酵液的酶活也随之增加，当乳糖终质量浓度为10 g/L时，CsCE酶活达到最大，随着乳糖浓度的进一步增加，发酵液的酶活反而降低，这主要是因为乳糖是以主动运输的方式进入细胞，需要消耗大量的质子推动力，过高浓度的乳糖会导致菌体能量的浪费［16］。因此选择10 g/L作为乳糖的最适诱导质量浓度。

图3B为乳糖诱导CsCE表达最佳时机的确定。在菌体生长的不同阶段加入乳糖均能诱导CsCE的表达，但发酵液的酶活存在较大差异。在菌体生长延滞期末期(OD600=0.2)加入乳糖，发酵液中菌体生物量偏小，CsCE诱导表达效果较差;在对数生长期初期(OD600=0.4和0.6)加入乳糖，此时目的蛋白表达量较高，且菌体生物量偏低，当OD600=0.6时，发酵液的酶活和比酶活均达到较高水平;在对数生长中期(OD600=0.8、1.0和1.2)加入乳糖，此时发酵液的酶活逐渐降低，而菌体生物量逐渐增大，比酶活随之降低，杂蛋白的表达量逐渐增加。因此选择在对数生长初期(OD600=0.6)时加入乳糖。

温度是调控酶蛋白表达的重要因素之一。从图3C可以看出，随着温度的升高，发酵液的酶活也随之增加。当发酵温度达到25℃时，发酵液的酶活处于最高水平，随着发酵温度的进一步提高，发酵液的酶活反而显著下降，这主要是由于较高发酵温度虽然有利于菌体细胞的生长，但是会形成大量的包涵体，不利于目的蛋白的表达，较低的诱导温度虽然会导致目的蛋白合成速率降低，但是有利于多肽链正确折叠形成有活性的酶蛋白［17］，但随着诱导温度的进一步降低，目的蛋白和菌体生物量均随之降低。综上考虑，乳糖的诱导温度选择25℃。

图3D为乳糖最适诱导时间的确定。较短的诱导时间不利于酶蛋白的形成，而较长的诱导时间不仅会浪费时间、增加能耗，还会因发酵体系的变化而导致酶蛋白活性的丧失。从图中可以看出，在0～20 h的诱导时间内，随着诱导时间的增加，发酵液的酶活显著增加，而后，随着诱导时间的进一步延长，发酵液的酶活保持稳定，但发酵液中菌体生物量逐渐增大，而导致最终比酶活降低。所以确定乳糖的最适诱导时间为20 h。

图3 乳糖对CsCE的诱导表达的效果Fig.3 Optimal conditions of lactose on the production of CsCE

表1是IPTG和乳糖分别作为诱导剂诱导CsCE表达效果的对比。在最适诱导条件下，乳糖诱导的发酵液的酶活达到801 U/L，是IPTG诱导的酶活力的2.4倍，发酵液中的菌体生物量也是IPTG诱导的2倍，这主要是由于乳糖作为诱导剂不会对细胞产生明显的毒害作用。从图4可以看出，发酵液中，乳糖诱导的目的蛋白表达量明显比IPTG诱导的目的蛋白要高，根据 2012年 Kim［9］以及 2014年顾俊艳等人［13］的报道可知，CsCE纯酶的比酶活为30 U/mg，定量计算出IPTG诱导的目的蛋白表达量约为11.4 mg/L，而乳糖诱导的目的蛋白的表达量约为27.1 mg/L。此外，乳糖诱导的粗酶液的比酶活比IPTG诱导的提高了37%。

表1 IPTG及乳糖诱导CsCE表达效果对比Table 1 Comparative analysis of IPTG and lactose on CsCE expression

2.3 CsCE的热处理纯化

pH和温度对摇瓶发酵液中CsCE的活力及稳定性的影响见图5。由图5可知，发酵液中CsCE的最适pH和温度分别为7.5和80℃，且在中性条件下(pH 6.5～8.0)酶活处于较高的水平。更重要的是CsCE是一种耐热性很强的酶，在80℃下半衰期约为2 h，60℃下的半衰期可达24 h。

图4 IPTG及乳糖诱导CsCE表达的SDS-PAGEFig.4 SDS-PAGE analysis of the effect of IPTG and lactose on CsCE expression

图5 CsCE的酶学性质Fig.5 Characterizations of CsCE

CsCE是目前最有潜力应用于工业化酶法生产乳果糖的酶，而如何实现CsCE的工业化生产则是当前亟待解决的问题。传统酶的分离纯化采用沉淀分离、膜分离以及层析分离等技术，但是在杂蛋白较多的体系中，直接采用上述分离纯化技术不仅难以达到很好的纯化效果，而且还会浪费时间，增加分离纯化的成本。而CsCE的酶学性质研究表明:CsCE具有很好的耐热性。本研究将CsCE的这种耐热特性应用于CsCE的初步纯化，结果如图6所示。

图6 热处理纯化CsCEFig.6 Thermal-Purification of CsCE

从图6可以看出，在60～75℃下短时间(10～20 min)的热处理即可除去发酵液中50%左右的杂蛋白，粗酶液的比酶活也随之变大。随着热处理温度的增大以及热处理时间的延长，粗酶液中可溶性蛋白含量逐渐降低(图6B)，比酶活逐渐升高(图6C)，但是从图6A粗酵液相对酶活的变化趋势中可以看出发酵液的总酶活也会逐渐降低，因此需要选择合适的热处理纯化工艺以获得较高的比酶活，同时总酶活的损失又不大。

表2是粗酶液在不同温度下经2 h处理后CsCE的纯化结果。粗酶液在70℃下经2 h热处理，与未热处理的对照组相比，可溶性蛋白浓度降低了85.9%，绝大部分的杂蛋白都变性沉淀，比酶活由粗酶液的0.89 U/mg变为纯化后的5.46 U/mg，纯化倍数达到6.14倍，且酶活回收率达到86.6%。从图7也可以明显地看出，随着热处理温度的提高，杂蛋白条带逐渐变少，而目的蛋白条带变化不大。综合考虑，选择70℃，2 h的热处理纯化条件。

表2 CsCE的热处理纯化结果Table 2 Summary of CsCE thermal-purification

图7 热处理纯化CsCE的SDS-PAGEFig.7 SDS-PAGE analysis of the purification of CsCE

3 结论

乳糖是一种有效的CsCE诱导表达剂。在最佳诱导条件下，乳糖诱导的E.coliBL21(DE3)发酵液中CsCE酶活是IPTG诱导的酶活的2.4倍，同时比酶活提高37%。乳糖在诱导的目的蛋白高效表达的同时，也会生成大量的杂蛋白。采用热处理对CsCE酶液进行纯化，经70℃、2 h的热处理，粗酶液中绝大部分的杂蛋白发生沉淀被去除，CsCE的比酶活由0.89 U/mg提高到5.46 U/mg，纯化倍数达到6.14倍，酶活回收率达到86.6%。

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