去肾交感神经术对心肌梗死后犬心脏氧化应激和交感神经重构的影响

宋立君，卢成志，李超，张瑾，王丽，马艺杰

去肾交感神经术对心肌梗死后犬心脏氧化应激和交感神经重构的影响

宋立君1，卢成志2△，李超2，张瑾2，王丽2，马艺杰3

目的观察去肾交感神经术（RDN）对犬心肌梗死（MI）后心脏氧化应激和交感神经重构的影响。方法将18只健康犬随机分为3组：假手术组6只，只行冠脉造影检查；心肌梗死组（MI组）6只，建立MI模型后1周行肾动脉造影检查；心肌梗死+RDN治疗组（MI+RDN组）6只，建立MI模型后1周行RDN治疗。明胶海绵栓塞法制作MI模型后4周，通过超声心动图测量各组犬左室舒张末期容积（LVEDV）、左室收缩末期容积（LVESV）、左室射血分数（LVEF）；免疫组化法检测梗死周边区酪氨酸羟化酶（TH）阳性神经纤维分布和密度；检测心肌氧化应激指标：超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量。结果与假手术组相比，MI组和MI+RDN组LVEF和SOD降低（P＜0.05），LVEDV、LVESV、MDA和TH阳性神经纤维相对表达量均增加（P＜0.05）。TH阳性神经纤维相对表达量与SOD呈负相关（rs=-0.818，P＜0.05），与MDA呈正相关（rs=0.900，P＜0.05）。MI+RDN组较MI组LVEF和SOD升高（P＜0.05），而LVEDV、LVESV、MDA和TH阳性神经纤维相对表达量均降低（P＜0.05）。结论RDN可以降低心脏氧化应激水平、抑制MI后心脏交感神经重构、改善心功能。

去肾交感神经术；心肌梗死；交感神经重构；氧化应激；动物，实验

急性心肌梗死中大约50%的心源性猝死患者是由于致命性室性心律失常所致，而心脏交感神经重构是室性心律失常和心源性猝死的重要原因［1］，其机制可能与氧化应激和炎症反应水平增加有关［2-3］。近年来，大量研究显示去肾交感神经术（RDN）具有较好的降压外治疗作用，如减轻左室肥厚［4］、改善心功能［5］和内皮功能［6］等。最近，Remo等［7］研究显示RDN还可以降低室性心动过速的发生率，但其机制仍不明确。本研究旨在观察RDN对心肌梗死（MI）犬交感神经重构的影响并探讨其相关机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料及分组健康成年杂种犬18只，雄性8只，雌性10只，体质量15～18 kg，由天津春乐实验动物中心提供。超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）检测试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。18只犬随机分为假手术组6只，只行冠状动脉（冠脉）造影，不建立MI模型，1周后行肾动脉造影检查；MI组6只，建立MI模型后1周只行肾动脉造影检查；MI+RDN组6只，建立MI模型后1周行RDN。

1.2 MI模型建立参照文献［8］方法，6%戊巴比妥钠30 mg/kg静脉注射麻醉，根据犬反应每30～60 min静脉追加50 mg。气管插管，机械通气（GSM-Ⅱ麻醉呼吸机），于股动脉穿刺置入6F鞘管，肝素抗凝。行冠状动脉造影，明确冠状动脉解剖结构，选择前降支第一对角支远端为栓塞部位，经微导管注射自制直径约1 mm的明胶海绵栓塞颗粒，手术时间60～90 min。栓塞完成后10 min再次造影，靶血管呈“残根样”，确认血流阻断。拔除股动脉鞘管，无菌纱布压迫止血后包扎。

1.3 去肾交感神经术犬背部皮肤粘贴消融电极板。射频消融仪（IBI-1500T，the United States IBI company）参数设定：温度43℃，消融功率10 W，消融时间90 s。灌注泵设置：肝素化盐水（5 000 U/500 mL）保持灌注量为2 mL/min；消融时灌注量为12 mL/min。股动脉穿刺并置入6F鞘管，通过6F JR4.0造影导管行双侧肾动脉造影，明确肾动脉位置及解剖结构，撤出造影导管。经动脉鞘将冷盐水消融导管（6F，Syn⁃aptic Medical，China）送入肾动脉内，通过导管尾端连接的三通阀注入造影剂以确定到达靶点位置。从肾动脉主干近端约二分之一段开始由远及近对两侧肾动脉沿轴向旋转进行3～4个位点消融。消融导管每到达一个新的消融靶点时，均先进行一次造影，以明确导管与血管壁贴靠是否良好。手术完成后，再次对肾动脉进行造影检查。

1.4 超声心动图检测MI后4周用飞利浦CX50行超声心动图检查，犬全麻后仰卧位固定，采用常规超声检查方法，记录左室舒张末期容积（LVEDV）、左室收缩末期容积（LVESV），应用Simpson′s双平面法测量左室射血分数（LVEF）。由2位检测者独立完成，取两者测量平均值为最终测定结果。

1.5 心肌SOD、MDA水平测定MI模型建立后4周，处死实验犬，迅速取出心脏，并用冰生理盐水洗净，取左心室（游离壁和室间隔）梗死周边区组织，用于检测SOD、MDA。按1∶10制成10%匀浆，4℃下3 000 r/min离心15 min，取上清待测。采用黄嘌呤氧化酶（羟胺）法检测SOD，采用硫代巴比妥酸（TBA）法检测MDA，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.6 酪氨酸羟化酶（TH）阳性神经纤维检测参照文献［9］方法，采用免疫组织化学方法检测心肌TH表达。取0.5 cm× 0.5 cm×0.1 cm心肌组织，磷酸盐缓冲液冲洗，固定、包埋、切片。参照试剂盒提供的步骤进行染色。选择实验组、对照组阳性和阴性组织进行×100和×400的显微照相，图像由计算机CMOS（OLYMPUS）及专用软件（Image-Pro Plus）系统处理，计算积分光密度（IOD）。

1.7 统计学方法采用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差表示。3组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t法。相关性分析采用Spearman相关。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验犬存活情况MI组和MI+RDN组各有1只犬分别于MI后1 d、3 d死亡，假手术组无死亡。2.2MI后各组超声心动图检测结果与假手术组比较，MI组和MI+RDN组LVEDV和LVESV增高，LVEF降低。MI+RDN组较MI组LVEDV和LVESV降低，LVEF增高（均P＜0.05），见表1。

Tab.1Echocardiography analysis between three groups表1 3组超声心动图检测结果

Tab.1Echocardiography analysis between three groups表1 3组超声心动图检测结果

＊＊P＜0.01；a与假手术组比较，b与MI组比较，P＜0.05；表2同

LVEDV（mL）30.75±1.80 41.24±2.56a 36.96±3.52ab 21.66＊＊组别假手术组MI组MI+RDN组F n6 5 5 LVESV（mL）13.72±1.16 25.92±1.38a 21.51±1.85ab 98.37＊＊LVEF 0.55±0.03 0.37±0.03a 0.42±0.03ab 56.96＊＊

2.3 MI后各组梗死区心肌MDA、SOD含量的变化MI组和MI+RDN组较假手术组梗死周边区心肌组织MDA含量升高，SOD含量降低；MI+RDN组较MI组MDA生成减少，SOD含量升高（P＜0.01），见表2。

Tab.2Comparison of MDA and SOD between three groups表2 3组MDA、SOD检测结果比较

Tab.2Comparison of MDA and SOD between three groups表2 3组MDA、SOD检测结果比较

组别假手术组MI组MI+RDN组F n6 5 5 MDA（μmol/g）1.92±0.37 3.67±0.59a2.65±0.30ab22.10＊＊SOD（U/mg）159.77±11.90 105.14±7.66a140.01±14.10ab30.79＊＊

2.4 各组TH水平的比较TH阳性神经纤维形态、分布见图1。MI后4周，假手术组、MI组、MI+RDN组TH阳性神经纤维相对表达量分别为66.82± 13.09、134.16±12.06及101.14±3.91，差异有统计学意义（F=53.81，P＜0.01）。其中MI组、MI+RDN组均高于假手术组，而MI+RDN组较MI组降低（P＜0.01）。

2.5 SOD、MDA与TH阳性神经纤维相对表达量相关性分析TH阳性神经纤维相对表达量与SOD呈负相关（rs=-0.818，P＜0.001），而与MDA呈正相关（rs=0.900，P＜0.001）。

Fig.1The distribution of TH positive staining nerve fibers（immunohistochemical，×400）图1 各组心肌TH阳性神经纤维分布（免疫组化，×400）

3 讨论

急性心肌梗死时支配心脏的神经会受到损伤，损伤的交感神经发生Wallerian变性，造成周围心肌失神经支配。神经生长因子（nerve growth factor，NGF）等在心肌或循环中的增加使神经鞘细胞增生与轴突再生，受损的神经发生重构，这些新生神经纤维以交感神经纤维为主［10］。在MI早期，交感神经适度再生是机体对于神经组织损伤修复的正常反应。但是，慢性期的神经再生往往是不均一并且过度增生，可能导致神经功能异常，对心肌的不应期、自律性和传导性产生影响，进而增加区域间电生理的异质性，从而增加恶性心律失常的发生率［11］。

研究显示，氧化应激和炎症反应对交感神经重构具有重要影响，它们可以通过上调NGF受体表达和增加NGF合成使神经过度增生［2-3］。活性氧自由基（ROS）是氧化应激主要效应分子，其生物学效应受多种抗氧化酶调节。在心血管系统中，SOD［12］、过氧化氢酶［13］等是重要的抗氧化酶类。MDA是氧自由基与细胞膜中多不饱和脂肪酸发生氧化反应所产生的一种小分子物质，其生成量不仅反映氧自由基生成与否，还反映脂质过氧化程度［14］。当ROS的生成与抗氧化系统失衡时即导致氧化应激。MI后释放大量ROS造成心肌细胞损伤并导致支配心脏的神经纤维重构。此后，氧化损伤仍持续存在，导致心室重构和心功能不断恶化［15］。本研究显示，MI后4周，与假手术组相比，MI组犬出现左心功能降低，心肌组织MDA水平增加，同时SOD水平降低，提示机体处于氧化应激状态。MI+RDN组较MI组LVEDV和LVESV降低，LVEF增加，提示MI+RDN组左心功能有所改善，提示RDN可能在改善左室舒张功能方面作用更加明显。此外，MI+RDN组较MI组心肌MDA降低，SOD增加，提示RDN降低了心肌氧化应激水平。

TH是肾上腺素和去甲肾上腺素合成过程中的关键酶，为交感神经特异性标志物。Wang等［16］研究显示，应用β受体阻滞剂美托洛尔可以抑制MI后兔心脏交感神经重构。本研究显示，MI后4周MI组TH阳性神经纤维相对表达量较假手术组增加，神经纤维直径粗大，形态和空间分布紊乱，表明MI后在神经损害基础上出现了交感神经过度增生，加重了神经支配的不均一性，且TH阳性神经纤维相对表达量与心肌氧化应激水平呈正相关；与MI组比较，MI+RDN组TH阳性神经纤维相对表达量减少，分布较均一，提示RDN具有抑制心脏交感神经重构的作用，而这种作用可能与氧化应激水平降低有关。

综上所述，通过RDN选择性阻断中枢和外周交感神经可以改善左心功能、降低心脏氧化应激水平、抑制心脏交感神经重构。

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（2014-12-17收稿2015-01-06修回）

（本文编辑陆荣展）

Effect of renal denervation on cardiac oxidative stress and sympathetic nerve remodeling after myocardial infarction in canine

SONG Lijun1，LU Chengzhi2△，LI Chao2，ZHANG Jin2，WANG Li2，MA Yijie3
1 Department of Gastroenterology of Tianjin First Center Hospital，Tianjin 300192，China；2 Department of Cardiology of Tianjin First Center Hospital；3 First Center of Clinical College，Tianjin Medical University△

ObjectiveTo observe the effect of renal denervation（RDN）on the cardiac oxidative stress and sympathetic nerve remodeling after myocardial infarction（MI）in canine.MethodsCanine（n=18）were randomly divided into three groups：Sham operation group（SHAM group，n=6），MI group（n=6），MI+RDN group（n=6）.Anterior myocardial infarction was gained by gelatin sponge embolization of the left anterior descending artery.At four weeks post-MI，left ventricular enddiastolic volume（LVEDV），left ventricular end-systolic volume（LVESV）and left ventricular ejection fraction（LVEF）were examined using echocardiography.Immunohistochemical assay was used to analyze the distribution and density of tyrosine hydroxylase（TH）stained nerve fibers at peri-infarct zone.Myocardial superoxide dismutase（SOD）activity and malondialde⁃hyde（MDA）were also assessed.ResultsCompared with dogs in SHAM group，LVEF and SOD expression were decreased in MI group and MI+RDN group（P＜0.05），but Left ventricular end diastolic pressure（LVEDP），LVEDV，LVESV，MDA and rate of TH positive staining nerve fibers were increased（P＜0.05）.There was a negative correlation between the rate of TH positive staining nerve fibers and SOD level（rs=-0.818，P＜0.05）and a positive correlation between rate of TH positive stain⁃ing nerve fibers with MDA level（rs=0.900，P＜0.05）.By contract，compared with MI group，LVEF and SOD in MI+RDN group were increased（P＜0.05），while LVEDV，LVESV，MDA and rate of TH positive staining nerve fibers were significant⁃ly lowered（P＜0.05）.ConclusionRDN is effective to decrease the level of cardiac oxidative stress and improve cardiac sympathetic nerve remodeling and heart function after myocardial infarction in canine.

renal denervation；myocardial infarction；sympathetic nerve remodeling；oxidative stress；animals，laboratory

R542.2

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.08.009

天津市应用基础与前沿技术研究计划（14JCYBJC26100）；天津市卫生局科技基金（2014KY11）

1天津市第一中心医院消化科（邮编300192），2心内科；3天津医科大学第一中心临床学院

宋立君（1985），男，硕士，主要从事高血压病基础和临床研究

△通讯作者E-mail：lucz8@126.com