广西壮族人群IL-12基因的单核苷酸多态性研究

陆潞，谢克恭，韦贵将，王俊利，陆敏安，乔宁宁，卢贤哲，唐毓金

细胞与分子生物学

广西壮族人群IL-12基因的单核苷酸多态性研究

陆潞，谢克恭，韦贵将，王俊利，陆敏安，乔宁宁，卢贤哲，唐毓金△

目的分析白细胞介素（IL）-12A基因单核苷酸多态性（SNP）位点rs568408和IL-12B基因SNP位点rs3212227的各基因型和等位基因在广西壮族人群中的分布频率，及不同地区的分布差异。方法采用单碱基延伸的PCR技术对165例广西壮族人群IL-12A rs568408和IL-12B rs3212227进行多态性检测，对比国际人类基因组计划（HapMap）公布的中国北京、日本、非洲和意大利人群的SNP分型数据，分析5个人群rs568408、rs3212227位点的基因型和等位基因频率差异。结果在广西壮族人群中存在rs568408和rs3212227多态性，2位点基因型及等位基因频率在男女性别间差异无统计学意义（P＞0.05），IL-12A rs568408与北京、日本和意大利人群差异无统计学意义（P＞0.05），但与非洲人群存在差异（P＜0.01）；IL-12B rs3212227与北京和日本人群差异无统计学意义，但与非洲和意大利人群存在差异（P＜0.01）。结论IL-12A rs568408和IL-12B rs3212227存在多态性，2位点基因型和等位基因在广西壮族人群中的分布频率与其他种族和地区人群相比存在差异，这种差异可能是导致某些疾病在不同人群发病率和临床表现存在差异的原因之一。

白细胞介素12；多态性，单核苷酸；广西［壮族自治区］；人种群

白细胞介素12（interleukin12，IL-12）是一种具有多种生物活性的异戊二聚体细胞因子，由p35和p40 2个亚基经二硫键连接形成，亚基分别由位于染色体3p12～q13.2的IL-12A基因和位于染色体5q31～33的IL-12B基因编码［1］。研究发现，IL-12A基因与IL-12B基因存在多个功能性多态性位点，且这些多态性位点可能影响恶性肿瘤［2］、自身免疫性疾病［3］、结核病［4-5］等疾病的发生和发展进程。因此，准确分析IL-12基因多态性在不同地区和不同人群中的分布，可以为基因多态性与某些疾病发生发展的关系提供更多有力的研究依据。本文采用SNaP⁃shot SNP分型技术检测165例广西壮族人群IL-12A基因rs568408位点和IL-12B基因rs3212227位点的遗传多态性，为与IL-12相关的遗传和疾病等方面的研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2012年10月—2013年10月到广西右江民族医学院附属医院进行健康体检的165例体检健康者作为考察对象。籍贯均为广西，无可查亲缘关系，向上追溯3代均为壮族人群，且长期在广西居住。其中，男97例，女68例，年龄18～71岁，平均（39.53±14.39）岁；各项临床及实验室检查指标均正常。

1.2 基因组DNA的提取清晨抽取健康体检者肘正中静脉血2 mL，用EDTA-K2抗凝；采用已建立的改良碘化钠法提取白细胞基因组DNA，-80℃冰箱保存备用。

1.3 聚合酶链反应（PCR）根据NCBI上查找的IL-12A、IL-12B基因DNA序列，选择包含rs568408位点和rs3212227位点的序列并输入引物设计软件Primer 5，得到用于特异性扩增包含rs568408位点IL-12A基因和rs3212227位点IL-12B基因的PCR上、下游引物和延伸引物。其中，rs568408位点的上游引物序列为5′-GAGGTCCCTCCAAA CCGTTGTC-3′，下游5′-CAGGATGGATATTTTCCCTTCT⁃TAGCA-3′，延伸引物序列为5′-ATGTCAAAAATACTTGAT⁃CAGAGGTAT-3′。rs3212227位点的上游引物序列为5′-GGCAACTTGAGAGCTGGAAAATCT-3′，下游：5′-TCCAG⁃GATGAAAATTTGGAGGAAAA-3′，延伸引物序列为5′-TTT TTTTTTGATATCTTTGCTGTATTTGTATAGTT-3′。PCR扩增反应体系共20µL，其中包括：10×PCR反应缓冲液2.0µL，0.3 mmol/L dNTPs 2.0µL，上、下游引物各1.0µL，基因组DNA 1.0µL，TaqDNA聚合酶1.0 U，不足体积用灭菌双蒸水补足至20µL。PCR反应条件：94℃，15 min；94℃×30 s，60℃× 30 s，72℃×20 s，共35个循环；72℃×10 min。PCR产物使用Qiagen公司的HotStarTaq进行多重PCR获得，4℃保存。

1.4 SNaPshot SNP分型技术PCR产物经虾碱酶和外切酶Ⅰ纯化后，用ABI公司的SNaPshot Multiplex kit进行延伸反应。延伸产物用虾碱酶纯化后在ABI3130XL上样。SNP分型用Gene Mapper 4.0（Applied biosystems）分析。

1.5 统计学方法采用SPSS 19.0软件进行统计分析。根据测序结果直接计算广西壮族人群2个位点的基因型和等位基因频率，Hardy-Weinberg遗传平衡采用χ2检验。登录NCBI查找HapMap公布的4个人群（北京人群、日本人群、非洲人群和意大利人群）2位点的分型结果，该人群与广西壮族人群的基因型和等位基因频率差异比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计意义。

2 结果

2.1 IL-12A rs568408和IL-12B rs3212227的检测结果包含IL-12A rs568408位点和IL-12B rs3212227位点的PCR扩增产物片段分别为210 bp和217 bp。ABI 3130XL的SNP分型结果显示，rs568408位点的基因型有3种，分别为AA、AG和GG，基因分型结果见图1。rs3212227位点的基因型有3种，分别为TT、TG和GG，因其为反向测序，反转后分别对应的基因型为AA、AC、CC，基因分型结果见图2。Hardy-Weinberg遗传平衡检测结果显示所选人群群体代表性好（均P＞0.05），可以反映广西地区壮族人群的总体情况，见表1。

Fig.1IL-12A gene rs568408 genotyping图1 IL-12A基因rs568408位点SNP分型结果

Fig.2IL-12B gene rs3212227 genotyping图2 IL-12B基因rs3212227位点SNP分型结果

2.2 IL-12基因多态性在广西壮族人群中的分布广西壮族人群中，rs568408位点的GG基因型最常见，为77.0%；G等位基因型的频率最高，为87.6%。rs3212227位点的AC基因型最常见，为43.6%；A等位基因型的频率最高，为50.3%。两位点基因型及等位基因频率男女组间比较差异均无统计学意义（P＞0.05），见表2、3。

Tab.1Hardy-Weinberg equilibrium test results of the IL-12A gene rs568408A/G genotype and the IL-12B gene rs3212227 genotype in Zhuang populations in Guangxi表1 广西壮族人群IL-12A rs568408A/G基因型和IL-12B rs3212227A/C基因型Hardy-Weinberg平衡检测结果

Tab.2Genotype distribution and allele frequency of IL-12A gene rs568408 in Zhuang populations in Guangxi表2 IL-12A基因rs568408位点基因型及等位基因频率在广西壮族人群的分布例（%）

2.3 IL-12基因多态性与其他人群的比较广西壮族人群IL-12A rs568408基因型和等位基因频率与北京、日本和意大利人群比较差异无统计学意义（P＞0.05），但与非洲人群存在差异（P＜0.01），见表4。IL-12B rs3212227基因型和等位基因频率与北京和日本人群比较差异无统计学意义（P＞0.05），但与意大利和非洲人群存在差异（P＜0.01），见表5。

Tab.3Genotype distribution and allele frequency of IL-12B gene rs3212227 in Zhuang populations in Guangxi表3 IL-12B基因rs3212227位点基因型及等位基因频率在广西壮族人群的分布例（%）

Tab.4Genotype and allele distribution of IL-12A gene rs568408 among different regional groups表4 不同地区人群IL-12A基因rs568408位点多态性分布频率的比较例（%）

Tab.5Genotype and allele distribution of IL-12B gene rs3212227 among different regional groups表5 不同地区人群IL-12B基因rs3212227位点多态性分布频率的比较例（%）

3 讨论

3.1 IL-12基因的免疫调节功能IL-12基因是由一种具有多种生物学活性的炎性细胞因子，主要由抗原激活的树突细胞（DC）、单核/巨噬细胞和B细胞等抗原提呈细胞（APC）产生［6］。IL-12在抗肿瘤及抗结核的免疫调节中发挥重要作用。IL-12能诱导T细胞和自然杀伤（NK）细胞释放干扰素γ（IFN-γ）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）破坏肿瘤内血管的生成，并激活P35途径促使肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤的进展［7］。研究发现，肿瘤抗原的致敏和基因修饰可促使小鼠DC分泌的IL-12和IFN-γ呈高表达［8］。在抗结核免疫中，能通过诱导CD4+T细胞向Th1细胞分化，促进单核巨噬细胞产生IFN-γ以及增加CD8+T细胞和NK细胞的细胞毒活性等方式参与机体对结核病的免疫应答［9］。

3.2 IL-12基因多态性与疾病在探讨IL-12与疾病相关性的过程中，国内外学者发现，IL-12A、IL-12B基因存在多种功能性多态性位点，基因的多态性影响体内IL-12的转录和表达，可能对疾病的发生和进展产生影响。Wang等［2］通过对106例骨肉瘤患者和210例健康人的IL-12A、IL-12B基因多态性检测发现，病例组rs568408位点GA、GA/AA基因型和rs3212227位点CC、AC/CC基因型显著高于对照组，且IL-12B rs3212227位点的基因多态性下调体内IL-12p40水平，IL-12基因多态性与骨肉瘤的易感性相关。Wong等［3］研究发现IL-12B rs3212227位点的基因多态性与强直性脊柱炎的发病风险具有相关性，该研究中，携带CC和AC基因型的人患强直性脊柱炎的风险分别是携带AA基因型的人的1.93倍和1.73倍，同时，IL-12B基因与IL-23R基因的交互作用影响着强直性脊柱炎的进展和严重程度。Peresi等［4］在巴西的研究发现来自IL-12B基因rs3212227 G/T位点的SNP能影响IL-12p40的表达水平，导致机体对结核分枝杆菌易感。Wang等［5］研究发现IL-12A基因的多态性可能与中国人肺结核的易感性有关，IL-12基因和IFNG基因的多态性可能单独或者协同影响肺结核遗传易感性及其预后。因此，准确分析IL-12A、IL-12B基因多态性在不同人群中的分布，可以为不同IL-12相关疾病的发生发展提供更多有力的证据。

3.3 广西壮族人群2位点基因多态性分布与其他人群的差异本研究显示，在广西壮族人群中，rs568408和rs3212227 2个位点基因型和等位基因频率男女性别间差异无统计学意义，说明2位点基因型分布可能与性别无关，对比HapMap上4个人群的SNP分型数据，2位点广西壮族人群的基因型和等位基因频率与亲缘关系相对较近同为黄种人的北京和日本人群比较差异无统计学意义，但是与亲缘关系相对较远的非洲黑种人相比存在差异。表明此2位点基因型分布可能与种族有密切关系，符合“亲缘关系越近，其基因型分布越相似，反之，则差异显著”的遗传学规律。在rs568408位点，广西壮族人群的基因型及等位基因频率与意大利人比较差异无统计学意义，而在rs3212227位点存在差异，则说明了在种族进化中的明显异质性，而这种遗传异质性以及基因多态性的差异，很可能是导致某些疾病在不同地区不同人群中发病率和临床表现存在差异的原因之一。

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（2014-10-21收稿2015-01-13修回）

（本文编辑李鹏）

Single nucleotide polymorphisms of IL-12 gene in Zhuang populations in Guangxi

LU Lu，XIE Kegong，WEI Guijiang，WANG Junli，LU Min'an，QIAO Ningning，LU Xianzhe，TANG Yujin△
Department of Spinal Orthopedic Surgery，First Affiliated Hospital，Youjiang Medical University for Nationalities，Baise Guangxi 533000，China△

ObjectiveTo investigate the frequencies of genotype and allele distribution of IL-12A gene single nucleo⁃tide polymorphisms（SNP）rs568408 and IL-12B gene SNP rs3212227 in Zhuang populations in Guangxi，and to compare the distribution of IL-12A and IL-12B polymorphisms among different races.MethodsThe IL-12A SNP rs568408 and IL-12B SNP rs3212227 were detected by SNaPshot SNP genotyping technique in 165 Zhuang people in Guangxi，frequen⁃cies of genotype and allele of IL-12A gene rs568408 and IL-12B rs3212227 polymorphisms were analyzed in Zhuang popu⁃lations compared with the other four populations（HapMap-HCB，HapMap-JPT，HapMap-YRI，HapMap-TSI）from Hap⁃Map database.ResultsThere were polimorphisms of IL-12A and IL-12B gene in Zhuang populations in Guangxi.The fre⁃quencies of allele and genotype distribution of IL-12A gene rs568408 polymorphisms were not significantly differenct com⁃pared with HapMap-HCB，HapMap-JPT and HapMap-TSI（P＞0.05），but were significantly different compared with Hap⁃Map-YRI（P＜0.01）；The frequencies of allele and genotype distribution of IL-12B rs3212227 polymorphisms were not sig⁃nificantly differenct compared with HapMap-HCB and HapMap-JPT（P＞0.05），but were significantly different compared with HapMap-YRI and HapMap-TSI（P＜0.01）.ConclusionThere are significant differences in the frequencies of allele and genotype distribution of IL-12A gene rs568408 and IL-12B gene rs3212227 between Zhuang populations and other eth⁃nic populations，and this variation might contribute to a variety of clinical manifestation and morbidity of some IL-12 related diseases.

interleukin-12；polymorphism，single nucleotide；Guangxi；ethnic group

R394.3

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.08.005

国家自然科学基金资助项目（81260315）；广西自然科学基金项目（2012GXNSFAA053169）；广西卫生厅医疗卫生重点科研课题项目（重2010059）；广西卫生厅自筹经费科研课题项目（Z2012712）

广西百色，右江民族医学院附属医院脊柱外科（邮编533000）

陆潞（1981），男，硕士在读，主要从事脊柱与骨关节疾病研究

△通讯作者E-mail：tangyujin196709@163.com