乙氧氟草醚对泥鳅肝细胞的毒性研究

夏晓华 夏晓培 董慧 等

摘要：以泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）为试验对象，通过急性毒性试验、单细胞凝胶电泳技术（彗星试验）、酶活测定来检测除草剂乙氧氟草醚对泥鳅肝细胞的毒性效应，从而研究了乙氧氟草醚对水生生物的毒性。结果表明，乙氧氟草醚对泥鳅的24、48、72、96 h的半数致死质量浓度（LC50）分别为36.67、32.87、28.38、27.40 mg/L，安全浓度为7.92 mg/L。彗星试验各试验组中，浓度越高，细胞的拖尾越严重，呈现明显的时间-剂量效应。低浓度乙氧氟草醚处理（8、12 mg/L）对泥鳅肝脏谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）具有诱导作用，而长时间（6 d）的高浓度乙氧氟草醚处理（16、20 mg/L）则具有抑制作用，试验组与对照组存在显著或极显著差异。

关键词：乙氧氟草醚；泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）；半致死质量浓度；单细胞凝胶电泳技术；GPT；GOT

中图分类号：S948 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）20-5092-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.20.042

Toxic Effects of Oxyfluorfen on Liver of Misgurnus anguillicaudatus

XIA Xiao-hua，XIA Xiao-pei，DONG Hui，LU Chen-hua，XU Pei-fang，DU Qi-yan，CHANG Zhong-jie

（College of Life Sciences， Henan Normal University， Xinxiang 453007， Henan， China）

Abstract： Loach as test object， by acute toxicity test， single cell gel electrophoresis （cometassay）， enzyme activity assay to detectd oxyfluorfen fluorine grass ethers of loach liver cell toxicity effect. The toxicity of oxyfluorfen to aquatic organisms were studied. The results showed that， half of oxyfluorfen on the 24，48，72，96 h lethal concentration（LC50） were 36.67，32.87，28.38， 27.40 mg/L， safe concentration for 7.92 mg/L. The experimental group， the higher concentration， the cell smearing more serious， also presents the obvious time dose effect. The activities of GPT and GOT in liver were induced by the lower concentration treatments（8，12 mg/L）， but restrained by the longer time（6 d） and higher concentration treatments （16，20 mg/L）. Experimental groups were significant difference or very significant difference in comparison with the control group. The results showed that the oxyfluorfen has a strong toxicity to Misgurnus anguillicaudatus.

Key words： oxyfluorfen； Misgurnus anguillicaudatus； lethal concentration；comet assay； GPT； GOT

泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus），隶属鳅科花鳅亚科泥鳅属，是一种抗污能力较强的淡水鱼[1]，其肉质佳、味道美，是老百姓餐桌上一道不可缺少的大餐。泥鳅可以适应多种混合养殖，最为常见的泥鳅养殖模式为稻鳅共作的嵌套种养模式。稻田间喷洒的农药，一部分作用于农作物水稻上，一部分散落在下层水体环境中影响嵌套养殖的泥鳅，而且残留的除草剂还有可能通过食物链进入人和牲畜的体内，不易降解，最终通过逐渐积累对人畜的机体造成损害。

乙氧氟草醚（Oxyfluorfen）又名氟硝草醚、果尔、割草醚，化学分子式为C15H11CF3NO4，含氟二苯醚类[2]，是一种高效的、水旱田兼用的、广谱的、苗前苗后触杀型除草剂[3]。近年来，许多专家学者对乙氧氟草醚的分析方法、药效试验、残留动态等开展了较为系统的研究[4-6]，而有关稻鳅嵌套种养过程中，其对泥鳅的毒性研究尚未见报道。单细胞凝胶电泳技术又称为“彗星电泳”，是一种在单个细胞水平上检测真核细胞DNA损伤与修复的方法，具有灵敏度高、迅速、简便、经济及所需细胞少等优点[7]。谷草转氨酶（简称GOT、AST）和谷丙转氨酶（简称GPT、ALT）是临床上检验肝功能是否正常的重要指标，可用来判断肝脏是否受到损害。本研究通过研究乙氧氟草醚对泥鳅肝细胞DNA损伤以及对其肝脏GPT和GOT活性的影响，旨在为乙氧氟草醚的合理使用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

泥鳅100尾，购自新乡市海鸿农贸市场，体量13～16 g/尾，体长9～12 cm。试验前用曝气3 d的自来水驯养一周，驯养期间死亡率小于2%，挑选健康活泼和体表无损的个体作为试验材料。试验前1 d停止喂食，进行饥饿处理，试验期间不投喂。曝气自来水48 h以上，水温11～23 ℃，溶解氧5～6 mg/L，pH 6.9～7.2。

乙氧氟草醚制剂购自新乡市东海农资市场。

1.2 试验方法

1.2.1 急性毒性试验 通过预试验确定最大零致死质量浓度和最小全致死质量浓度。本研究设20.83、25.00、30.00、36.00、43.20 mg/L 5个等比浓度梯度试验组和1个空白对照组，每组投放10尾泥鳅，每24 h更换1次等体积等浓度的乙氧氟草醚，试验开始后12 h连续观察，记录其中毒症状以及24、48、72及96 h的死亡数量。试验重复3次。

采用改进寇氏法（Karber）[8，9]计算乙氧氟草醚对泥鳅的半数致死质量浓度LC50，其计算公式为LgLC50=Xm-i（∑p-0.5），安全浓度SC的计算公式：SC=LC50（48 h）×0.3/[LC50（24 h）/LC50（48 h）]2。

式中，Xm为死亡组最大剂量的对数；i为相邻组浓度对数之差；p为各组的死亡率，∑p为各组死亡率的总和。

1.2.2 彗星试验 在急性试验结果基础上，在安全浓度和最大零致死质量浓度之间，设8、12、16、20 mg/L 4个处理组和1个空白对照组，每组随机投放20尾泥鳅，每24 h更换1次等体积等浓度的乙氧氟草醚。分别设置2、4、6 d 3个时间区段组，每次每个时间每个浓度取2尾制备肝细胞悬液，试验步骤参照陈忻等[10]的方法进行。试验重复3次。

1.2.3 酶活测定 处理组与彗星试验相同。试验开始后每组每2 d随机取2尾泥鳅，取出肝脏，各按1∶99加入鱼用生理盐水进行研磨，制成1%匀浆。将匀浆移入2个离心管中， 2 500 r/min离心10 min，用于谷丙转氨酶（GPT）活力和谷草转氨酶（GOT）活力的测定，然后计算泥鳅GPT、GOT活力的平均值。GPT和GOT匀浆活力分别用谷丙转氨酶试剂盒（赖氏法）和谷草转氨酶试剂盒（赖氏法）测定，用BCA法测定组织蛋白质含量。试验重复3次。

1.2.4 数据处理 单细胞凝胶电泳试验运用CASP彗星图像分析软件进行分析，得出彗星尾部DNA百分含量（Tail DNA）、彗星尾部长度（Tail length，TL）、Olive尾矩（Olive tail moment，OTM）3项指标数据，导入统计分析软件SPSS进行统计分析。

肝细胞酶活试验所有试验数据均采用Excel 2003软件进行数据的处理与分析，并用SPSS 13.0软件进行差异性分析。

2 结果与分析

2.1 乙氧氟草醚对泥鳅的急性毒性试验结果

不同浓度的乙氧氟草醚对泥鳅活动的影响有明显的差别。在低剂量组（20.83、25.00 mg/L）中，泥鳅基本上没有出现异常的行为变化。但在高剂量组（36.00、43.20 mg/L）中，泥鳅不断地快速游动，有时狂游跃出水面，最终逐渐失去游动能力，翻白肚直至死亡。不同质量浓度的乙氧氟草醚稀释液对泥鳅的急性试验结果见表1。由表1可知，乙氧氟草醚对泥鳅24、48、72、96 h的半数致死质量浓度（LC50）分别为36.67、32.87、28.38、27.40 mg/L，安全质量浓度为7.92 mg/L。

2.2 乙氧氟草醚对泥鳅肝细胞DNA损伤试验结果

单细胞凝胶电泳结果表明，对照组细胞核均呈现圆球形，彗星头部DNA致密且集中。随着浓度的增加，各处理组细胞核呈现彗星样，彗星头部逐渐缩小，发散程度增加（图1）。

利用彗星图像分析软件CASP及统计软件SPSS对各浓度组彗尾DNA所占百分含量（Tail DNA）、尾长（TL）和Olive尾距（OTM）3个指标进行测量，结果见表2。在2 d肝细胞组中，泥鳅的彗尾DNA含量、尾矩、尾长均随着浓度的增加而增大，与对照组相比差异极显著（P<0.01），并在20 mg/L时达到峰值。肝细胞彗尾DNA含量为（22.54±3.67）%，尾长为（187.00±22.63）%，尾矩为（21.45±5.12）%，表明在处理时间为2 d的情况下，随着乙氧氟草醚浓度的增加，对泥鳅细胞的DNA损伤也越严重。在4 d肝细胞组中，试验结果所呈现的趋势大致与2 d组相同，且3项指标在20 mg/L中同样也达到峰值，与对照组相比差异极显著（P<0.01），并且较2 d组而言，3项指标数值都有了大幅度的提升，表明乙氧氟草醚对泥鳅肝细胞DNA的损伤有时间剂量效应，达到峰值时肝细胞彗尾DNA含量为（31.71±1.95）%，尾长为（231.00±9.90）%，尾矩为（43.24±3.14）%。

2.3 乙氧氟草醚对泥鳅肝细胞酶活的影响试验结果

乙氧氟草醚处理后对泥鳅肝脏GPT及GOT活力的影响试验结果见表3。不同浓度乙氧氟草醚处理2 d和4 d，均导致泥鳅肝脏中的GPT与GOT活性升高，20 mg/L乙氧氟草醚处理4 d后均达到最大，分别为40.20、46.04 U/g。处理6 d后，GPT与GOT活性均有所下降。

3 小结与讨论

本研究以泥鳅为试验材料，参照2009年新版《国际危规》分类标准，该标准将化学物质对鱼类的毒性分为3个等级[11]，当96 h的LC50大于10 mg/L时属于低毒。本试验中乙氧氟草醚对泥鳅的96 h的半致死质量浓度为27.40 mg/L，表明乙氧氟草醚对泥鳅的毒性属于低毒。

单细胞凝胶电泳与经典的染色体畸变、微核相比，适用于研究低剂量及高剂量下的生物效应、活细胞及死亡细胞DNA的检测，非常适用于评价受试物的遗传毒性。本试验结果表明，随着乙氧氟草醚浓度的增加和处理时间的延长，彗尾DNA、尾长、尾矩均逐渐增大，在处理时间为6 d，浓度为16 mg/L时达到最大[彗尾DNA为（46.21±1.40）%，尾长为（314.00±25.46）%，尾矩为（124.62±10.01）%]，说明此时的DNA损伤最严重，在20 mg/L浓度组中，3个指标均出现一定程度地下降，说明此时DNA的损伤程度有所缓解。推测可能的原因有两种：一种是与DNA自身的修复机制有关，DNA受到严重损伤时，启动SOS修复机制，使DNA的损伤程度减轻，使得拖尾现象不明显；二是高浓度、长时间处理以后，DNA受损伤过大以致彗星电泳时DNA片段分散太开，在镜检时形成的彗星尾部荧光信号太弱，故呈现出测量值下降的表象[12]。

GPT和GOT是肝脏中活性最强的两种转氨酶，在机体蛋白质代谢中起着重要的作用，其活性变化与肝细胞的炎症、变性和坏死等密切相关[13]，是肝细胞受损最灵敏的指标。肝脏是重要的解毒器官，能够将有毒的物质最终转换为尿素排出体外。本研究测定了不同浓度乙氧氟草醚在不同时间处理下，泥鳅肝脏中GPT和GOT的活性变化。结果表明，在低浓度短时间的处理条件下，肝脏GPT和GOT活性均较对照组有了明显的升高，说明乙氧氟草醚在较低浓度下短时间内诱导GPT和GOT活性显著升高，加强机体对毒物的代谢；但是在处理时间延长为6 d的较高浓度组中（16、20 mg/L），这2种酶的活性开始降低，甚至低于空白对照，表现出非常明显的抑制效应。这可能是由于长期处于胁迫作用下，泥鳅肝细胞受到一定程度的损伤，其功能开始下降。

综上所述，本研究表明一定浓度的乙氧氟草醚能够造成泥鳅肝细胞DNA的损伤，并且影响肝脏转氨酶的活性，为在农业生产中合理使用除草剂，提高泥鳅产量，更好地发挥嵌套养殖的优势提供依据。

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