恙虫病东方体三种膜蛋白抗原包被酶联免疫吸附试验的特异性和敏感性分析*

汪鹏程 熊小路 焦 俊 龚文平 杨晓梅 温博海

(1.军事医学科学院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全国家重点实验室，北京 100071；2.中国人民解放军第105医院检验科， 合肥 230031)

恙虫病(Tsutsugamushi disease/fever)，又称丛林斑疹伤寒(scrub typhus)，是由恙虫病东方体(Orientiatsutsugamushi)引起的一种自然疫源人兽共患急性发热性疾病。啮齿动物(鼠类)是该病的主要传染源，恙螨(特别是纤恙螨属Leptotrombidium)的幼虫是其传播媒介(Traubetal., 1974)。恙虫病主要在亚洲和的太平洋地区流行(Wattetal., 2003)，我国从南到北大部分地区存在恙虫病，近年在某些地区出现恙虫病暴发流行(Deetal., 2015)。恙虫病临床上以突然高热、浅表淋巴结肿大、虫咬处溃疡焦痂和皮疹为主要特征(Wattetal., 2003)。虽然该病用四环素、氯霉素等抗生素治疗有效，但是很多患者的临床症状不典型，容易造成误诊而延误治疗，甚至引起患者死亡(Deetal., 2015)。因此，迫切需要建立有效、实用的方法对恙虫病进行临床实验室诊断。

目前，恙虫病临床实验室诊断的主要方法是血清学检测，采用恙虫病东方体制备抗原片做间接免疫荧光分析(IFA)，检测患者血清中恙虫病东方体特异性抗体。恙虫病东方体是专性细胞内寄生菌，不能在人工培养基上生长，需要靠接种鸡胚或细胞才能繁殖恙虫病东方体制备IFA抗原片。由于抗原片制备复杂，难以标准化等限制了IFA恙虫病抗体检测在临床实验室中的应用。采用恙虫病东方体抗原做酶联免疫吸附分析(ELISA)，检测恙虫病特异性抗体是目前国外实验室用于代替IFA的新型恙虫病实验室诊断方法(Chenetal., 2011)。采用恙虫病东方体全细胞抗原裂解物与恙虫病患者血清做免疫印迹，发现与患者血清反应的主要抗原成分有110、58、56、47和22 kDa抗原(Hanson, 1985;Oaksetal., 1989)。56和47 kDa蛋白和是恙虫病东方体的最主要表面蛋白抗原(Oaksetal., 1989)，而58 kDa蛋白是一热休克蛋白(Hsp60)(Stoveretal., 1990)。免疫印迹分析显示几乎所有恙虫病患者血清均能与这3个蛋白反应(Hanson,1985)。本实验室已经将恙虫病东方体的这3个主要蛋白抗原的基因克隆表达，制备r58、r56和r47 kDa重组蛋白。本研究用这3个重组蛋白做抗原建立ELISA方法，分别用这3种抗原包被ELISA检测恙虫病东方体实验感染小鼠血清以及恙虫病患者血清，并同时检测其他立克次体感染小鼠血清和患者血清，以便对这3种抗原ELISA的特异性和敏感性进行分析，为其进一步的实际应用提供必要的依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

Ni-NTA纯化试剂盒为德国QIAGEN产品；低分子量蛋白Marker等为中科瑞泰(北京)生物科技有限公司产品；FITC、HRP标记羊抗小鼠/人IgG购自北京博奥森公司；96孔ELISA板购自美国康宁公司；ELISA包被液、封闭液、TMB反应底物、终止液均购自eBioscience公司。

多种立克次体抗原片，包括恙虫病东方体Origentiatsutsugamushi、贝氏柯克斯体Coxiellaburnetii、黑龙江立克次体Rickettsiaheilongjiangensis、莫氏立克次体Rickettsiamooseri为本实验室制备。

无特殊病原BALB/c小鼠(6周龄，雄性)由军事医学科学院动物中心提供。

1.2 立克次体菌株与实验感染小鼠血清

恙虫病东方体(Karp株)、贝氏柯克斯体(新桥株)、莫氏立克次体(Wilmington株)、黑龙江立克次体(054株)为军事医学科学院微生物流行病研究所立克次体学实验室保存。用以上立克次体分别腹腔接种BALB/c小鼠，感染4周后活杀小鼠取血，分离血清，血清置-20℃冻存备用。血清用相应的立克次体抗原片按常规方法做间接免疫荧光，其IgG抗体效价≥1∶200。

1.3 立克次体患者血清

恙虫病、Q热、斑点热、斑疹伤寒患者血清由安徽医科大学公共卫生学院柳燕教授、广州第八人民医院、江苏省疾病预防控制中心分别惠赠。以上患者血清用相应的立克次体抗原片按常规方法做间接免疫荧光，其特异性IgG抗体效价≥1∶100。

1.4 恙虫病东方体重组蛋白制备

将本室制备的恙虫病东方体Karp株47、56、58 kDa蛋白基因重组大肠埃希氏菌(Yuetal., 2005)接种含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB液体培养基。按常规方法用IPTG诱导转化菌表达重组蛋白，对复苏的重组菌做聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，鉴定重组菌表达的目的蛋白。对表达目的蛋白重组菌接种含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB液体培养基，用IPTG诱导目的蛋白表达。用Qiagen公司的Ni-NTA试剂盒从裂解的重组菌中分离纯化目的重组蛋白。

1.5 ELISA检测立克次体感染小鼠/患者血清

将纯化的重组蛋白用ELISA包被液稀释至3 μg/mL，再分别加至ELISA板各孔中(每孔100 μL)4℃包被过夜。包被结束后弃上清，加入PBST进行洗涤(每孔加入200 μL，摇振5 min)，拍干后每孔加入200 μL封闭液4℃过夜，PBST洗涤3次后待用。将每份大肠埃希氏菌(5 mg/mL)中和后血清用封闭液作1∶200倍稀释。将每份稀释血清加入到相应孔中，37℃孵育1 h。PBST洗涤3次后拍干，加入1∶4000稀释的辣根过氧化酶(HRP)标记的山羊抗小鼠或人IgG抗体，37℃孵育1 h。PBST洗涤3次后拍干。每孔加入100 μL TMB底物，10 min后加入100 μL终止液，立即于酶标仪上测定OD450值。

1.6 统计学分析

每组血清与单个重组蛋白反应OD450值差异采用单因素K水平方差分析及Student-Newman-Keuls分析。以上统计学分析均使用SAS 9.1软件完成。统计正常血清与每个蛋白反应OD450值，以正常小鼠血清或正常人血清与单个蛋白反应OD450平均值加3倍标准差为Cut-off值，判断感染血清与该蛋白反应阳性及阴性结果。分析每个主要血清反应蛋白与其他立克次体感染血清反应的OD450值来分析恙虫病东方体重组蛋白抗原的特异性。

2 结果

2.1 恙虫病东方体重组蛋白的制备

将恙虫病东方体47、56、58 kDa蛋白基因重组菌接种含有氨苄青霉素LB液体培养基。在IPTG诱导下，这3个重组菌均表达目的蛋白。采用Ni-NTA对表达的重组蛋白进行分离纯化，SDS-PAGE分析确认获得分子量与设计大小一致的3个重组蛋白(r47、r56、r58 kDa蛋白)(图1)。

图1 SDS-PAGE分析恙虫病东方体重组蛋白在大肠埃希氏菌中表达Fig.1 SDS-PAGE analysis for the expression of recombinant proteins of Orientia tsutsugamushi in E.coli cells

2.2 ELISA分析恙虫病重组蛋白与小鼠血清反应敏感性及特异性

将恙虫病东方体、贝氏柯克斯体、黑龙江立克次体、莫氏立克次体感染小鼠血清以及正常小鼠血清各8份分别与恙虫病东方体r47、r56、r58 kDa蛋白进行ELISA反应，结果显示每种重组蛋白至少与7份恙虫病东方体感染血清阳性反应，每个重组蛋白与恙虫病东方体感染血清的平均反应OD值均显著高于与其他立克次体感染小鼠血清的平均OD值(表1，图2)。而其他立克次体感染小鼠血清与这3种重组蛋白的反应均为阴性。

2.3 ELISA分析恙虫病重组蛋白与患者血清反应敏感性及特异性

将12份恙虫病、11份Q热病人、13份斑点热、11份斑疹伤寒患者血清、17份正常人血清与恙虫病东方体47、56、58 kDa蛋白行ELISA反应，结果显示12份恙虫病患者血清中有11份与这3种重组蛋白的反应为阳性，恙虫病患者血清与每一种蛋白反应的平均OD值均显著高于与其他立克次体感染患者血清反应的OD值(表2)。而其它立克次体感染患者血清与这3个恙虫病东方体重组白的反应阳性数为0或1～3份。

表1 立克次体感染小鼠血清与恙虫病东方体r47、r56、r58 kDa蛋白的ELISA反应强度及阳性数Tab.1 The reaction intensities and positive rates of sera from mice infected with different rickettsiae in ELISA with 47-, 56-, or 58-kDa recombinant protein of Orientia tsutsugamushi

表2 立克次体感染患者血清与恙虫病东方体r47kD、r56kD、r58kD蛋白的ELISA反应强度及阳性率Tab.2 The reaction intensities and positive rates of sera from patients suffered from different rickettsial diseases in ELISA with 47-, 56-, or 58-kDa recombinant protein of Orientia tsutsugamushi

图2 立克次体感染小鼠血清与恙虫病东方体r47、r56、r58 kDa蛋白的ELISA反应强度散点图Fig.2 The reaction intensities of sera from mice infected with different rickettsiae in ELISA with 47-, 56-, or 58-kDa recombinant protein of Orientia tsutsugamushi

图3 立克次体感染患者血清与恙虫病东方体r47、r56、r58 kDa蛋白的ELISA反应强度散点图Fig.3 The reaction intensities of sera from patients suffered from different rickettsial diseases in ELISA with 47-, 56-, or 58-kDa recombinant protein of Orientia tsutsugamushi

3 讨论

恙虫病东方体的47、56、58 kDa表面蛋白为其主要抗原。58 kDa蛋白为Hsp60家族成员，虽然细菌热休克蛋白为高保守蛋白，但是基因序列分析证明恙虫病东方体58 kDa蛋白基因与最近缘的斑疹伤寒立克次体的Hsp60也有较大的差异；免疫印迹分析显示58 kDa蛋白与其他立克次体Hsp60蛋白免疫血清仅有微弱的交叉反应；58 kDa蛋白在恙虫病东方体菌株之间则为高度保守，提示58 kDa蛋白适用于做恙虫病血清学诊断抗原(Stoveetal., 1990)。56 kDa蛋白为恙虫病东方体特有的外膜蛋白，用重组56 kDa蛋白做包被抗原对澎湖列岛恙虫病患者血清做ELISA分析，发现98%的患者血清有特异性IgM抗体升高，100%的患者血清有特异性IgG抗体升高,证明56 kDa蛋白具有很好的恙虫病血清学特异性和敏感性(Chenetal., 2011)。47 kDa蛋白为细菌HtrA(High-temperature requirement A)家族蛋白，该蛋白位于革兰阴性菌的外膜和周浆。47 kDa蛋白也是恙虫病东方体的保守蛋白，免疫印迹分析证明其能与大多数恙虫病患者血清反应(Chenetal., 2009)；用47 kDa蛋白做包被抗原对澎湖列岛恙虫病患者血清做ELISA分析，结果显示76% 和 93% 的恙虫病患者血清分别有升高的特异性IgM和IgG抗体，证明其也具有很好的恙虫病血清学特异性，但敏感性比56 kDa蛋白稍差(Chenetal., 2011)。

采用Ni-NTA对表达的重组蛋白进行分离纯化，SDS-PAGE分析中47和58 kDa蛋白分别有两条带，可能与蛋白降解有关。本研究用恙虫病东方体r47、r56、r58 kDa蛋白分别做包被抗原对恙虫病东方体感染小鼠血清做ELISA分析。结果显示8份恙虫病感染小鼠血清中除1份血清与r58 kDa蛋白的IgG特异抗体反应为阴性外其它均为阳性；而这3个重组蛋白与贝氏柯克斯体(Q热病原体)、莫氏立克次体(地方性斑疹伤寒病原体)、黑龙江立克次体(远东斑点热病原体)感染小鼠血清的IgG特异抗体反应均为阴性，证明这3个重组蛋白抗原均具有识别恙虫病东方体感染血清的高度特异性和敏感性，可用作恙虫病的血清学诊断抗原。

为了进一步证明它们做恙虫病血清学诊断抗原的可行性，将r47、r56、r58 kDa分别做包被抗原对恙虫病患者血清做ELISA。结果显示12份恙虫病患者血清对这3个蛋白抗原的IgG特异抗体反应仅1份为阴性，阳性率均为91%。同时，r47 kDa抗原对11份Q热患者血清、11份斑疹伤寒患者血清、13份斑点热患者血清的IgG特异抗体反应阳性率分别有27%、18%、23%(平均23%)，r56 kDa抗原对这3种患者血清分别为27%、0%、8%(平均11%)，r58 kDa抗原则分别为18%、18%、23%(平均20%)。这些结果显示这3个恙虫病东方体重组蛋白抗原均有识别恙虫病患者血清的良好特异性和敏感性，特别是r56 kDa抗原对斑疹伤寒和斑点热患者血清的交叉反应水平很低。由于本研究所收集的患者血清绝大多数来自农村地区，这些恙虫病东方体IgG抗体阳性的Q热、斑疹伤寒、斑点热患者可能曾经得过恙虫病。因此，如果用这3种恙虫病东方体抗原做ELISA，检查患者血清中的特异性IgM抗体可以排除交叉反应，提高该ELISA血清学诊断的特异性。

本研究首次将恙虫病东方体r58、r56、r47 kDa重组蛋白同时做ELISA检测恙虫病东方体、贝氏柯克斯体、莫氏立克次体、黑龙江立克次体实验感染小鼠血清和临床患者血清，证明它们均有识别恙虫病东方体感染的良好特异性和敏感性。这4种立克次体感染为我国农村地区常见传染病，用这3种重组蛋白抗原建立的ELISA将为我国恙虫病血清学诊断提供新的有效方法。