不同比例附子配黄连在Caco-2细胞模型中跨膜转运研究*

周旺洋 贺秀云 刘梦婷 吕秋菊 秦海燕 李越兰 宋捷民△

（1.浙江中医药大学附属第三医院，浙江 杭州 310005；2.浙江中医药大学，浙江 杭州310053）

不同比例附子配黄连在Caco-2细胞模型中跨膜转运研究*

周旺洋1贺秀云2刘梦婷2吕秋菊2秦海燕2李越兰2宋捷民2△

（1.浙江中医药大学附属第三医院，浙江 杭州 310005；2.浙江中医药大学，浙江 杭州310053）

目的 通过Caco-2细胞模型，研究不同比例的附子配黄连在Caco-2细胞中主要成分的吸收和转运情况。方法 利用Caco-2细胞模型和高效液相色谱法，研究附子配黄连比例为1∶1、1∶2、2∶1时的吸收和转运，计算跨膜转运量和表观渗透系数，3种比例药物配伍对吸收和转运的影响。结果 附子∶黄连比例为1∶1、1∶2、2∶1时，盐酸小檗碱在150min时的跨膜转运量AP→BL侧分别为0.625，0.161，0.055μg，BL→AP侧分别为1.308，0.178，0.064μg，表观渗透系数分别为2.095，1.107，1.172μg，次乌头碱在150min时的跨膜转运量AP→BL侧分别为0.634，0.401，0.204μg，BL→AP侧分别为0.534，0.108，0.067μg，表观渗透系数分别为0.842，0.268，0.328。结论 附子配黄连1∶1用量比优于1∶2、2∶1的用量比，证明临床用量比的最佳性。

附子配黄连 比例 Caco-2细胞 跨膜转运

附子配黄连，出自《伤寒论》附子泻心汤。后世医家在治寒热错杂的方剂中每每用之，附子黄连，一热一寒，寒温并用。临床上常用于寒热互结所致的心下痞满，寒热夹杂之泻痢，上热下寒之口疮足冷等证。但在诸方剂中，二药配伍比例各不相同。有文献报道，黄连与附子不同配伍比例对小鼠胃肠运动影响各异［1］。为此本研究选用目前应用最佳的体外吸收Caco-2细胞模型，测定二药不同配伍的吸收、转运特征，以研究附子配黄连之间的相互作用和生物利用度。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞与试药 Caco-2细胞株购自上海细胞库，传代数为25～50代。RPMI-1640细胞培养液（吉诺生物医药技术有限公司，产品型号：GNM31800-S）；0.25%胰酶（凯基生物医药技术有限公司，产品型号：KGM27250）；D-Hanks缓冲液（吉诺生物医药技术有限公司，产品型号：GNM14175）；胎牛血清（产品型号：Gibco，16000044）；MEMNEAA非必需氨基酸溶液100X（产品型号：Gibco，11140050）；L-谷氨酰胺 （杭州昊天生物技术有限公司，产品型号：PYG21051）；碱性磷酸酶ALP/AKP试剂盒 （南京建成生物工程研究所）；MTT（产品型号：Amresco 0793）；二氯甲烷（天津市永大化学试剂有限公司）；次乌头碱标准品 （中国食品药品检定研究院，110798-201106）；盐酸小檗碱（中国药品生物制品检定所，批号：110713-200911）。药材附子选自四川绵阳市江油恒源药业有限公司附子GAP基地，黄连购自重庆市石柱县黄水镇黄连GAP基地，药材经浙江中医药大学中药鉴定教研室张水利教授鉴定，附子为毛莨科植物乌头（AconiLum carmichaeli Debx.）的子根的加工品，黄连为毛茛科植物黄连（Coptis chinensis Franch）的干燥根茎。经学院制剂室提取得附子提取物 （自制，13011706，乌头碱、次乌头碱和新乌头碱的含量分别为2.29、2.76、2.02mg/g）、黄连提取物（自制，12122110）。分别精密称取黄连自制品、附子自制品适量，折合药材质量比例，制得附子∶黄连分别为1∶1（药对1），1∶2（药对2），2∶1（药对3）的溶液，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，存于4℃冰箱待用。

1.2 实验仪器 CO2培养箱 Thermo scientific；SWCJ-ZFD型双人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司；TE-2000-S倒置显微镜，日本尼康；LDZ5-2低速自动平衡医用离心机，北京医用离心机厂；R502B SENCO恒温水浴，上海森信实验仪器有限公司；YXQ-280SD型蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；680型酶标仪，Thermo scientific；十万分之一天平，Mettler Toledo；DGG 9240B型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；跨膜电阻仪，Millicell-ERS，Millipore corporation，USA；24孔Transwell小室，Greiner；24孔贴壁细胞培养板，Greiner；96孔细胞培养板，Corning；25 cm2细胞培养瓶，Corning；0.22μm微孔滤器，Corning；岛津LC高效液相色谱仪（日本岛津公司）；色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6mm× 150mm，5μm）。

1.3 确定附子黄连的配伍比例 从转化医学角度出发，附子配黄连用量比例应来自于临床。笔者整理研究了历代著名方书中129张含有附子、黄连的方剂，分析研究后，结果表明：有59张方附子配黄连用量比是为1∶1；10张方附子配黄连为2∶1；16张方附子配黄连为1∶2。确定临床使用较多的3种附子配黄连用量比例1∶1、1∶2、2∶1，作为在Caco-2细胞模型中吸收和转运情况用药配伍比例。

1.4 建立细胞单层模型 在接种细胞前1 d将24孔Transwell小室置于4.5%CO2，37℃恒温培养箱中孵化一夜。取对数生长期细胞按细胞传代的方法消化离心，加培养液稀释成细胞混悬液，按1×105个/mL，300μL接种到Transwell聚酯（PET）上，另取RPMI-1640细胞培养液1500μL于24孔板中。接种后前14 d每隔1 d换1次液，以后每天换液，培养21 d左右［2-3］。

1.5 转运实验 待Caco-2细胞在Transwell培养板上形成紧密、完整的单细胞层后，吸去培养液。各孔贴壁加入37℃的D-Hanks液，在不破坏细胞层的条件下，荡洗细胞3次，吸干各孔内D-Hanks液。当研究药物从AP侧→BL侧转运时，在24孔Transwell培养板上AP侧加入0.3mL药物，BL侧加入1.5mLD-Hanks缓冲液；当研究药物从BL侧→AP侧转运时，在AP侧加入0.3 mL D-Hanks缓冲液，BL侧加入1.5 mL药物；然后把Transwell培养板放在37℃，4.5%CO2培养箱里培养，分别在90、120、150min从接收侧（加D-Hanks缓冲液一侧）吸取0.1mL接收液于EP管中，并放置于-80℃冰箱待测，每次补足相应量的D-Hanks缓冲液［4］。

HPLC检测各成分含量。色谱条件为，色谱柱：A-gilent ZORBAX SB-C18（4.6mm×150mm，5μm），流动相：甲醇（B相）-0.1%甲酸（A相），总流速：1.00mL/min，检测波长：237 nm，柱温：（25±1）℃，进样量：20μL。见表1。

表1 色谱条件

转运试验中加入空白转运液的一侧为接收室，接收室的药量视为吸收量（Qri）。AP-BL转运试验中，BL室药量为吸收量；BL-AP转运试验中，AP室药量为吸收量，由于双向转运空白转运液体积不同，累计吸收量的计算公式略有差异。每个时间点取样后，样品不再返还Transwell系统，但要补加相同体积的空白转运液，以保持溶液体积不变。具体计算方法见以下公式：

AP→BL QrB=0.1（Qr1+Qr2+……+Qr（i-1））+1.5Cri，

BL→AP QrA=0.1（Qr1+Qr2+……+Qr（i-1））+0.3Cri，

上式中，1.5、0.3分别为接收室所加D-Hanks液体积（mL），0.1为取样体积（mL），Cri为接受室第i个时间点实测药物浓度（i=1～3）。

药物透过Caco-2细胞单层的表观穿透系数用Papp（cm/s）值作为参考，按下式进行药物转运率计算：

其中△Q（μg）为△t（s）内的转运量，A（0.33 cm2）为细胞单层膜面积，Co（μg/mL）为供给室药物初浓度。两侧转运率比值Pratio的计算公式：

其中Papp（BL-AP）和Papp（AP-BL）分别为双向表观渗透系数［5］。

1.6 方法学考察

1.6.1 线性关系考察［6］精密称取盐酸小檗碱标准品0.21mg于10mL容量瓶中，用二氯甲烷溶解稀释至刻度，用D-Hanks缓冲液稀释成13.12，26.25，52.5，105，210 ng/mL的溶液；精密称取次乌头碱标准品1.05mg于10mL容量瓶中，用二氯甲烷稀释至刻度，再用DHanks分别稀释成65.62，131.25，262.5，525，1050 ng/mL的溶液；其中二氯甲烷的浓度小于0.5%将不会影响单细胞层的完整性。进行HPLC色谱分析，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，分别做标准曲线。盐酸小檗碱的标准曲线为：y=473.89x-473.08（r=0.9997），次乌头碱的标准曲线为：y=220.75x-1648.8（r=0.9991）。盐酸小檗碱在13.125～210 ng/mL，次乌头碱在65.625～1050 ng/mL的范围内峰面积与浓度呈良好的线性关系。

1.6.2 稳定性考察［7］精密吸取盐酸小檗碱、次乌头碱标准溶液20μL，分别于0、2、4、6、8、10 h进行测定，计算各峰面积标准偏差。盐酸小檗碱、次乌头碱标准偏差分别为2.76%、1.19%。

1.6.3 精密度考察［8］分别精密吸取盐酸小檗碱、次乌头碱标准溶液20μL，各重复进样6次，计算各峰面积标准偏差。盐酸小檗碱、次乌头碱标准偏差分别为1.80%、0.42%。

1.6.4 专属性实验［9］分别精密吸取D-Hanks缓冲液（含0.25%二氯甲烷）、盐酸小檗碱标准品、次乌头碱标准品20μL，进行HPLC分析，考察分析方法专属性。结果溶剂对成分检测无干扰。

1.7 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件。计量资料以（±s）表示，采用方差分析和t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 MTT实验结果 药对1、药对2、药对3分别在2.18～34.80、4.44～71.00、1.15～18.4（μg/mL，以盐酸小檗碱计）内对Caco-2细胞为非细胞毒性计量，选取安全浓度进行吸收与转运实验，分别为34.80、71.00、18.4μg/mL。

2.2 3个比例药对在各个时间段的跨膜转运量 见表2～4。利用HPLC方法测定3个比例药对在各个时间段的跨膜转运量。结果显示盐酸小檗碱和次乌头碱的跨膜转运量随时间的增加而不断增加。在不同时间点，药对1中盐酸小檗碱和次乌头碱的转运量大于另外两个药对。

表2 药对1主要成分在不同时间的跨膜转运量△Q（μg，±s）

表2 药对1主要成分在不同时间的跨膜转运量△Q（μg，±s）

药物 转运方向 90min 120min 150min盐酸小檗碱AP→BL 0.039±0.006 0.540±0.186 0.625±0.170（n=3）BL→AP 0.033±0.012 0.862±0.059 1.308±0.613次乌头碱AP→BL 0.241±0.029 0.546±0.014 0.634±0.031（n=3）BL→AP 0.060±0.012 0.382±0.006 0.534±0.033

表3 药对2主要成分在不同时间的跨膜转运量△Q（μg，±s）

表3 药对2主要成分在不同时间的跨膜转运量△Q（μg，±s）

药物 转运方向 90min 120min 150min盐酸小檗碱AP→BL 0.027±0.006 0.119±0.009 0.161±0.026（n=3）BL→AP 0.074±0.010 0.146±0.006 0.178±0.008次乌头碱AP→BL 0.335±0.042 0.339±0.056 0.401±0.044（n=3）BL→AP 0.045±0.006 0.081±0.011 0.108±0.007

表4 药对3主要成分在不同时间的跨膜转运量△Q（μg，±s）

表4 药对3主要成分在不同时间的跨膜转运量△Q（μg，±s）

药物 转运方向 90min 120min 150min盐酸小檗碱AP→BL 0.037±0.002 0.048±0.005 0.055±0.007（n=3）BL→AP 0.024±0.007 0.039±0.008 0.064±0.015次乌头碱AP→BL 0.152±0.015 0.176±0.004 0.204±0.036（n=3）BL→AP 0.034±0.001 0.046±0.005 0.067±0.003

2.3 盐酸小檗碱和次乌头碱的表观转运系数（Papp）和双向转运率（Pratio） 见表5，表6。根据公式计算盐酸小檗碱和次乌头碱的Papp和Pratio。结果盐酸小檗碱在药对1中以主动转运为主，而在药对2和药对3中则表现为以被动转运为主。次乌头碱表现为以被动转运为主。

表5 盐酸小檗碱的Papp和Pratio比较（±s）

表5 盐酸小檗碱的Papp和Pratio比较（±s）

药对n Papp（AP→BL）Papp（BL→AP）Pratio（×10-6cm/s） （×10-6cm/s） （BL→AP/AP→BL）药对1 3 6.043±1.640 12.659±5.9352.095药对2 3 0.765±0.125 0.846±0.0401.107药对3 3 0.998±0.122 1.169±0.2781.172

表6 次乌头碱的Papp和Pratio比较（±s）

表6 次乌头碱的Papp和Pratio比较（±s）

药对n Papp（AP→BL）Papp（BL→AP）Pratio（×10-6cm/s） （×10-6cm/s） （BL→AP/AP→BL）药对1 3 15.705±0.759 13.216±0.8260.842药对2 3 9.925±1.094 2.662±0.1620.268药对3 3 5.069±0.880 1.663±0.0640.328

3 讨 论

Caco-2细胞于1977年由Fogh等首次分离自人类结肠腺癌细胞，其结构和功能类似于分化的小肠上皮细胞，具有微绒毛，紧密连接等结构，并含有与小肠刷状缘上皮相关的酶系和一定程度的蛋白表达，因此Caco-2细胞模型的跨膜转运实验，可以用来模拟药物在体内的经小肠上皮吸收过程。本研究采用Caco-2单细。可在细胞水平上提供药物分子透过小肠黏膜的吸收、分布、代谢、转运以及毒性的综合信息。

中医临床上不少急症处方有寒性热性药物合用，如治蛔厥腹痛的乌梅丸，治肝火内郁、胃脘剧痛、呕吐酸水的连附六一汤等，中药“寒热并用”在机体内的作用机制如何，尚不完全清楚。本实验借助寒热药性有代表性的附子配黄连为载体，通过建立Caco-2细胞模型，研究不同比例附子黄连配伍后在Caco-2细胞中的吸收与转运机制，以探究的寒药热药配伍后对机体的影响。附子味辛、甘，大热，有毒，功效回阳救逆、补火助阳、散寒止痛。其中乌头碱、中乌头碱、次乌头碱被证实是附子发挥强心、抗炎、镇痛功效的有效成分。黄连味苦性寒，能清热燥湿，泻火解毒，含有多种生物碱，其中主要生物碱为小檗碱。其具有广谱抗生素的作用，在临床上长期以来用于降热镇痛、抗肠道细菌感染。目前关于附子黄连配伍在细胞层面研究尚未见报道。鉴于二者配伍之主治多在胃肠，而Caco-2细胞又能模拟小肠上皮细胞之功能，故利用其研究甚为合适。

本文首次报道关于利用Caco-2细胞模型研究附子黄连不同配伍后的成分吸收变化。通过建立Caco-2细胞模型，研究不同比例附子黄连配伍后在Caco-2细胞中的吸收与转运机制。实验结果提示：盐酸小檗碱、次乌头碱作为附子黄连配伍后的主要有效成分，性质稳定，建立的检测方法稳定可靠，可作为检测指标说明实验结果。其次，小檗碱和次乌头碱的转运量大小依次为1∶1＞1∶2＞2∶1。结果显示附子配黄连比例为1∶1最有利于有效成分的吸收及利用。与历代方书中1∶1使用最多相合，证明了中医历代以来附子配黄连1∶1配伍的科学性，为临床中附子黄连配伍比应用提供了实验室依据。有实验表明，单用黄连，其所含的小檗碱在胃肠道吸收不好［10］。在Caco-2细胞模型中药物分子的Papp与口服吸收相关联，因为Papp的大小直接反映药物经肠道的吸收能力。吸收良好药物的Papp大于1×10-6cm/s，而吸收差的药物，其Papp小于1×10-7cm/s［11］。本实验中不同配比的附子配黄连中，小檗碱和次乌头碱的Papp均大于1×10-6cm/s，说明附子配黄连用量比例1∶1、1∶2、2∶1均具有良好的口服吸收性。盐酸小檗碱在药对1∶1中表现为以主动转运为主，在药对1∶2、2∶1表现以被动转运为主。提示附子配黄连的寒热偏性对物质的吸收转运方式有一定的影响，具体机制有待更深入研究。

［1］张媛，王建，王琼，等.黄连与附子对小鼠胃肠运动的影响［J］.时珍国医国药，2008，19，（10）：2456.

［2］谢社平，谭晓蜻，毕开顺，等.盐酸巴马汀在Caco-2细胞中的吸收机制［J］.中国实验方剂学志，2011，17（3）：209-213.

［3］韩天娇，宋凤瑞，刘忠英，等.附子配伍过程中二菇类生物碱在Caco-2小肠吸收细胞模型中吸收转运的UPLC/MS研究［J］.化学学报杂志，2011，69（15）：1795-1802.

［4］姚媛，廖琼峰，谢智勇，等.新穿心莲内醋在Caco-2细胞单层模型中的吸收机制研究［J］.中国实验方剂学杂志，2014，20（14）：113-116.

［5］高秀蓉，蒋学华，杜青青，等.基于Caco-2细胞模型研究蝙蝠葛碱的跨膜吸收机制［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18（15）：139-143.

［6］戚娟，郭涛，李海燕，等.黄连多组分在Caco-2细胞单层模型的吸收及其相互作用［J］.中草药杂志，2013，44（13）：1801-1806.

［7］吴安国，曾宝，王春玲，等.HPLC考察小檗碱和黄连提取物中小檗碱在Caco-2细胞模型的转运［J］.中国药理学通报，2011，27（7）：1007-1011.

［8］王素军，王广基，李晓天，等.LC-MS法测定槐果碱及其在Caco-2细胞上的转运特征［J］.中国中药杂志，2007，32（1）：57-60.

［9］冯志强，谢智勇，廖琼峰，等.氧化槐果碱在Caco-2细胞模型中的吸收机制研究［J］.中国中药杂志，2011，36（17）：2399-2403.

［10］张伯莎，安叡，王跃，等.黄连生物碱类成分经Caco-2细胞模型转运的协同作用研究［J］.中成药杂志，2012，34（1）：15-18.

［11］鄢良春，刘青春，赵军宁，等.小柴胡汤在Caco 2细胞模型的吸收特性和转运机制研究［J］.中国中药杂志，2011，36（8）：1087-1090.

Research of Transmembrane Transport of Different Proportions of Fuzi（Aconitum carmichaeli debx.）with Huanglian（Coptis chinensis）in Caco-2 Cells Model

ZHOU Wangyang1，HE Xiuyun2，LIU Mengting2，et al. 1 The Third Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University，Zhejiang，Hangzhou 310005，China；2 Zhejiang Chinese Medical University，Zhejiang，Hangzhou 310053，China

Objective：To study the absorption and transport condition of the main components of different proportions of Fuzi（Aconitum carmichaeli debx.）with Huanglian（Coptis chinensis）in Caco-2 cells model.Methods：The Caco-2 cells model and high performance liquid chromatography （HPLC）method were establish to study the absorption and transport condition when the aconite-coptis ratio was 1∶1，1∶2，2∶1.The transmembrane transport amount and the apparent permeability coefficients were calculated the influence of the 3 ratios of the two drugs on absorption and transport.Results：When the aconite-coptis ratio was 1∶1，1∶2，2∶1，respectively，the transmembrane transport amounts（μg）at 150min of berberine hydrochloride on AP→BL side are 0.625，0.161，0.055.On BL→AP side were 1.308，0.178，0.064，and the apparent permeability coefficients were 2.095，1.107，1.172，the transmembrane transport amounts（μg）at 150min of hypaconitine on AP→BL side were 0.634，0.401，0.204，on BL→AP side were 0.534，0.108，0.067，and the apparent permeability coefficients were 0.842，0.268，0.328.Conclusion：The aconite-coptis ratio of 1∶1 was better than the ratio of 1∶2 and 2∶1.It is proved the best clinical ratio.

Fuzi（Aconitum carmichaeli debx.）with Huanglian （Coptis chinensis）；Ratio；Caco-2 cell；Trans-membrane transport

R289.5

A

1004-745X（2015）05-0753-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.05.001

2015-02-01）

国家自然科学基金面上项目（81073067）

△通信作者（电子邮箱：ssc3631@163.com）