云南省蚊媒病毒分离物的初步鉴定*

赵秋敏 郭晓芳， 左曙青 周红宁 张久松**

(1. 军事医学科学院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全国家重点实验室，北京 100071； 2. 云南省寄生虫病防治所，云南普洱665000)

虫媒病毒(Arthropod-borne virus, arbovirus)是一类由吸血节肢动物传播能引起人畜疾病的病毒,主要引起脑炎、肝炎、出血热、关节炎等严重症状(自登云等,1995)。迄今为止已发现的虫媒病毒多达550余种，其中130余种对人、畜有致病作用(Gaoetal., 2010)。国内对虫媒病毒的研究起步较晚，目前被证实有人间流行的虫媒病毒仅有5种，它们是流行性乙型脑炎病毒、森林脑炎(春夏季脑炎)病毒、新疆出血热病毒、登革病毒1～4血清型及新布尼亚病毒。我国幅员辽阔，地理景观复杂，地跨寒、温、热三带，存在多种媒介昆虫和宿主，应有多种虫媒病毒存在的可能。近20年来，我国加强了对虫媒病毒自然疫源地调查和病原体分离工作，特别是在蚊传虫媒病毒的分离与鉴定方面取得了一定的进展，获得了近20种新的病毒株(Gaoetal., 2010)。云南省位于我国的西南部，属热带、亚热带气候，物种多样，生态环境复杂。为增加对该地区虫媒病毒的了解，我们于2007～2011年在云南省西部地区开展了蚊媒病毒的调查研究，分离到多株病毒，其中5株初步鉴定为盖塔病毒(Getah virus, GETV)，结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 蚊虫标本的采集与分离

2007～2011年在云南省从野外采集蚊虫标本，同一采集时间、地点、蚊种按50～100只分为一组，置于预冷的玻璃研磨器内。加入1 mL RPMI-1640培养液研磨制成匀浆，4℃,12 000 r/min离心30 min。取上清接种白蚊伊蚊C6/36细胞，吸附1 h后，弃上清，加入9 mL细胞维持液，置于28℃培养箱。每日观察细胞病变情况，盲传3代，出现规律性病变者即为分离阳性。

1.2 病毒株及其增殖

将5株GETV分离物GETV-A87-09、GETV-A123-09、GETV-A132-09、GETV-A134-09和GETV-A137-09(GenBank 登录号KP900941～KP900945)(除GETV-A123-09分离自中华按蚊Anophelessinensis，其余均来自三带喙库蚊Culextritaeniorhynchus在生物安全柜中打开，取100 μL用细胞维持液稀释至1 mL，加至单层白蚊伊蚊C6/36细胞中吸附1 h，补加9 mL细胞维持液，置32℃、5% CO2条件下培养5～7 d，收集培养上清液，用于细胞敏感性试验和RT-PCR检测。

1.3 细胞敏感性试验

选择GETV-A87-09作为代表株，分别接种C6/36细胞、猴肾细胞(Vero)、金黄地鼠肾细胞(BHK-21)及狗肾细胞(MDCK)，倒置显微镜下逐日观察细胞病变效应(CPE)。同时，进行组织半数感染量(TCID50)测定(李钟铎，2002)。

1.4 病毒分离物RT-PCR与核苷酸序列测定

取病毒感染的C6/36细胞上清液，采用RNA提取试剂盒(QIAamp Viral RNA Mini Kit，QIAGEN公司)，按照说明书提取病毒RNA，加入随机引物合成cDNA。然后，以合成的cDNA为模板，用甲病毒属通用引物进行PCR扩增(Wangetal.，2011)。上游(M2w，164～186 bp)和下游(cMw3，568～597 bp)引物序列分别为：(CT)AG AGC (AGT)TT TTC GCA(CT)(GC)T (AG)GC (ACT)(AT)和ACA T(AG)A AN(GT) GNG TNG T(AG)T C(AG)A ANC C(AGT)A (CT)CC，编码部分甲病毒RNA依赖的 RNA 聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)。反应体系包括：H2O 20.8 μL，10×PCR Buffer 3 μL，1 mmol/L dNTP Mixture 3 μL，上游引物(10 pmol/μL) 1 μL，下游引物(10 pmol/μL)1 μL，Tag酶0.2 μL(5 U/μL)，cDNA模板1 μL。扩增条件为94℃ 3 min；94℃ 30 s，50℃ 60 s，72℃60 s，35个循环；72℃延伸10 min。扩增产物约为434 bp。PCR产物送北京诺赛基因组研究中心有限公司测序，测序结果经BLAST比对分析。

1.5 序列与系统进化分析

采用DNAStar软件进行病毒核苷酸序列同源性分析。参考国际病毒分类委员会(ICTV)公布的第9版病毒分类报告，从基因库中选出16株病毒作为系统进化分析的参考序列，主要包括盖塔病毒6株及已发现的甲病毒科病毒株，详细情况由表1所示。采用Mega 5.0软件最大似然法(Maximum-likelihood)构建病毒系统进化树。

2 结果

2.1 病毒的细胞敏感性

用GETV-A87-09病毒株接种上述4种传代细胞，除MDCK细胞外，其他3种细胞均出现规律性CPE。病毒在C6/36细胞出现CPE的时间为48～72 h，以细胞皱缩、脱落、细胞间隙增大为特征(图1)，病毒的TCID50滴度较高为6.5；在Vero细胞上，接种后24～48h出现CPE, 以细胞皱缩、脱落、胞内颗粒变粗为特征, TCID50为4.0；在BHK-21细胞上，出现CPE的时间24～48h，以细胞肿胀、梭状，细胞单层拉开为特征, TCID50为3.0。

图1 病毒对C6/36、Vero及BHK-21细胞的致细胞病变作用(×100)Fig.1 Cytopathic effect induced by GETV-A87-09 strain on C6/36, Vero and BHK-21 cells (original magnification ×100)1.病毒感染C6/36细胞; 2. 正常C6/36细胞; 3. 病毒感染Vero细胞; 4. 正常Vero细胞; 5. 病毒感染BHK-21; 6. 正常BHK-21细胞。1.Virus-infected C6/36 cells; 2. Normal C6/36 cells; 3. Virus-infected Vero cells; 4. Normal Vero cells; 5. Virus-infected BHK-21 cells; 6. Normal BHK-21 cells

2.2 新分离株核苷酸序列分析

经BLAST比对，新分离物核苷酸序列与GETV同源性最高。5株病毒与GETV中国云南YN0540株、河北株HB0234、韩国株、海南株M1及LEIV17741MPR株的同源性分别为97.9%～99.0%、97.2%～98.2%、97.9%～99.0%、97.2%～99.2%及97.2%～98.2%，与鹭山病毒(Sagiyamavirus, SAGV)的同源性为96.4%～97.4%(表2)。5株病毒之间的同源性为98.4%～100%。

表1 系统进化分析中所用的病毒株及其序列信息Tab. 1 Information of reference sequences used in phylogenetic analysis in this study

表2 新分离病毒株核苷酸序列同源性 (%) 比较Tab. 3 Nucleotide sequence homology (%) among the new isolates and reference GETV strains

2.3 新分离株系统进化分析

系统进化分析结果显示，5株新分离株基因序列与GETVYN0540株、HB0234株及韩国株亲缘关系最近，其次为LEIV17741MPR株、M1株及SAGV。这些毒株与GETV LEIV16275Mag株聚在一群(图2)。

图2 基于GETV部分非结构蛋白1基因片段的系统进化分析Fig.2 Phylogenetic analysis based on the partialnon-structural protein 1 gene sequences病毒株及其序列信息请参见表1。Strains and their sequence information are shown in Tab. 1

3 讨论

GETV属于披膜病毒科、甲病毒属、西门利克森林病毒复合群成员，能在各种脊椎动物和节肢动物体内增殖(自登云等,1995)。1955年首次在马来西亚采集的一组白雪库蚊中分离到GETV(Moritaetal.，1984)。已证实该病毒可引起猪、马等家畜的疾病，在人引起的疾病只限于发热。血清流行病学调查结果显示，GETV在欧亚大陆至东南亚、远到东亚、太平洋岛屿及澳大利亚等地区都有分布(Fuknaqaetal.，2000)。

我国1964年于海南省(Lietal.，1992)首次分离到GETV，近年来又在多个地区，包括云南(Wangetal.，2011)、河北(王焕琴等，2006；梁勇等，2010)、上海(Zhaietal.，2008)、甘肃(翟友刚等，2008)等采集的蚊虫标本中分离到该病毒，表明该病毒在我国分布较为广泛。此外，20世纪90年代对南方11个地区进行的调查结果表明，人群血清中GETV抗体的阳性率为0.18%(方美玉等，2003)。本研究获得的病毒分离物可使C6/36、Vero及BHK-21细胞出现规律性的CPE，与此前的研究结果相一致(付士红，2012)。5株病毒部分核苷酸序列与GETV 相似性最高，经系统进化分析与GETV处于同一进化分支，进化关系最近，证实为GETV。2005年云南省首次从中华按蚊和骚扰阿蚊分离到GETV(Zhaietal.，2008)，周晓芳等(2012)将2005年从云南省边境采集的白蚊伊蚊分离的一株病毒分离物鉴定为盖塔病毒。此外，河北省涉县等地均从三带喙库蚊中分离出盖塔病毒。本研究中新获得的GETV分离物来自云南采集的三带喙库蚊和中华按蚊，表明云南省有多个蚊种均可携带该病毒。从地区分布来看，以往报告的GETV均来自于云南省南部边境地区，本研究获得的GETV除了云南省南部以外，在澜沧江上游和中游地区也分离到该病毒，说明GETV在云南省广泛分布。此外，新分离物均采用甲病毒通用引物被确定，可为今后虫媒病毒的调查与鉴定提供借鉴。

我国对GETV的研究报告不多，对其媒介和宿主的分布情况尚不清楚，对人群的危害程度亦不知，应进一步加强研究。