西沙野生诺尼叶片内生菌的分离与初步鉴定

白飞荣, 刘 洋,*, 曹艳花, 姚 粟, 李金霞, 谭望桥, 程 池,*

（1.中国食品发酵工业研究院中国工业微生物菌种保藏管理中心，北京 100015；2.海南诺尼生物工程开发有限公司，海南海口 570125）

西沙野生诺尼叶片内生菌的分离与初步鉴定

白飞荣1, 刘 洋1,*, 曹艳花1, 姚 粟1, 李金霞1, 谭望桥2, 程 池1,*

（1.中国食品发酵工业研究院中国工业微生物菌种保藏管理中心，北京 100015；2.海南诺尼生物工程开发有限公司，海南海口 570125）

主要研究西沙群岛野生诺尼叶片中可培养内生菌的多样性。利用常规平板分离方法进行菌株分离。通过测定真菌核糖体基因翻译间隔序列（ITS序列）和细菌16S rDNA基因序列，结合系统发育研究对所分离菌株进行鉴定分析。共分离到32株内生菌，分为19种。其中2种霉菌，共2株，分别属于炭层菌属（Nemania sp.）和毛壳菌属（Chaetomium sp.）；细菌17种，共30株，分别属于芽孢杆菌属（Bacillus sp.）、赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillus sp.）、微球菌属（Micrococcus sp.）、土地芽孢杆菌属（Terribacillus sp.）、肠杆菌属（Enterobacter sp.）、黄单胞菌属（Xanthomonas sp.）、黄杆菌属（Flavobacterium sp.）等7个已知属，其中芽孢杆菌属（Bacillus sp.）为绝对优势属，共20株，11种。

西沙野生诺尼叶片；内生细菌；群落多样性

诺尼（Morinda citrifolia Linn.）又称为海巴戟天、海滨木巴戟、诺尼、水冬瓜，被子植物门（Angiospermae）木兰纲（Magnoliopsida）茜草目（Rubiales）茜草科（Rubiaceae）巴戟天属（Morinda）植物，是一种热带常绿多年生阔叶灌木或小乔木［1］，主要分布在南太平洋热带诸岛，菲律宾，澳大利亚，柬埔寨以及我国海南岛，我国西沙群岛和我国台湾岛［2］。早在2000多年前，波利尼亚人就利用诺尼叶片来治疗各种疾病，以及为服装染色［3］。近年来，国内外科学研究主要针对诺尼的生理生化方面，已证明诺尼中含有莨菪亭、钾、维生素C、萜类化合物、生物碱、蒽醌、甲基醚、谷甾醇、胡萝卜素、维生素A、黄酮、亚油酸、茜素、氨基酸等多种化学成分［4-5］。通过免疫机理的研究，证实了诺尼具有各种医疗保健作用，包括抗肿瘤、抗氧化、抗菌消炎、抗焦虑、抗皱、护肝、改善糖尿病、改善痛风等功效［6-11］。2002年欧洲食品科学委员会（Scientific Committee on Food，SCF）对诺尼进行了食品安全性鉴定，认为其是安全的。诺尼作为一种国际上比较流行的多功能保健产品，其产品具有广阔的市场前景，值得深入研究。

诺尼叶片呈深绿色，有光泽，膜质，对生，椭圆形或广椭圆形，长10～25 cm，宽5～10 cm，顶端急尖或短渐尖，基部阔楔形；侧脉每边6～7条，在叶片腹面微凸起，背面凸起明显，脉腋内常有短束毛；叶柄长5～12 mm；托叶大，膜质，长5～12 mm，顶端钝［12］。诺尼新鲜叶子可直接咀嚼或包裹，或者加水熬汁饮用或浸泡，也可晒干磨成粉末。在巴西称诺尼叶为“止痛草”，其对牙龈炎、牙周病、喉痛、喉炎、感冒、头痛、发烧、风湿性关节炎、痛风、骨折、扭伤、皮肤病等均有一定的功效［13］。

内生菌（endophytes）是一类可以和植物互利共生的微生物，经研究证明它们可以增加植物的生长发育和抗逆能力，也可通过产生一些代谢产物，而提高植物的药用性能［14］。本文主要研究诺尼叶片中可培养内生菌的多样性，将为诺尼叶片中功能性微生物的开发利用奠定良好的基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

实验样品为野生诺尼的新鲜叶片（见图1），采集自中国海南省三沙市永兴岛（北纬16.83°，东经112.34°），共计645 g。样品存放无菌自封袋中，4℃保存。

图1 野生诺尼叶片样品Fig.1 Wild Noni leaves samples

1.2 培养基

玫瑰红钠和PDA培养基用于真菌的分离纯化，R2A和LB培养基用于细菌的分离纯化，均购于北京陆桥公司。

1.3 内生菌的分离培养和保存

采用稀释平板涂布法分离培养诺尼叶片中的内生菌。取不同枝条上的健康叶片，称取10 g进行表面灭菌，先用无菌水冲洗2次，滤纸吸干水分后，用体积分数为75%的酒精浸泡30 s，再用质量分数为0.1%的氯化汞溶液浸泡3 min，最后用无菌水冲洗3次。用无菌剪刀剪碎叶片，于无菌研钵中加入少量灭菌的石英砂和碳酸钙及少量无菌水充分研磨，然后依次用无菌水稀释成质量分数为1×10-1、1× 10-2、1×10-3的组织悬液。

分别取100 μL悬液涂布于玫瑰红钠平板（平板含有25 mg/mL氯霉素和25 mg/mL四环素）和R2A平板上，每个处理3个平行。玫瑰红钠平板置于25℃培养箱培养，从第2 d开始对平板上的单菌落进行分离计数，共7 d，根据菌落形态（包括大小、形状、颜色、质地、有无渗透液，有无可溶性色素等），对可培养真菌进行初步筛选，并利用PDA培养基平板纯化菌株；R2A平板置于28℃培养箱培养，从第一天开始对平板上的细菌单菌落进行分离计数，共4 d，根据菌落形态（包括大小、形状、颜色、表面光泽度、边缘整齐度、透明度和质地等）进行初步筛选，利用LB培养基平板划线纯化菌株。纯化好的菌株，利用试管保藏备份，并提交给中国工业微生物菌种保藏中心（CICC）保藏。

1.4 内生菌的DNA提取与鉴定

1.4.1 内生真菌的DNA提取与扩增

采用传统CTAB抽提方法，提取内生真菌基因组DNA，采用通用引物：ITS1（5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′）和ITS4（5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′）扩增ITS基因序列［15］。PCR反应体系为：模板10×PCR buffer 5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）4 μL、模板2 μL、Taq DNA聚合酶1 μL、引物各1 μL，补充去离子水至50 μL。反应条件：94℃5 min；94℃50 s，55℃50 s，72℃50 s，33个循环；72℃7 min。PCR产物用1%凝胶电泳进行检测，约为600 bp。

1.4.2 内生细菌的DNA提取与扩增

利用天根公司细菌基因组提取试剂盒，提取内生细菌基因组DNA，采用通用引物：27f（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492r（5′-GGTTACCT TGTTACGACTT-3′）扩增16S rDNA基因序列。PCR反应体系同真菌体系。反应条件：94℃5 min；94℃1 min，55℃1 min，72℃1.3 min，35个循环；72℃10 min。PCR产物用1%凝胶电泳进行检测，约为1 500 bp。

所有PCR产物都送交上海生工生物工程技术服务有限公司测序，真菌序列与GenBank数据库中已知序列进行BLAST比对分析，细菌序列与EzBio-Cloud数据库比对，寻找具有较高同源性的目标序列。确定各菌株的有效序列后用ClustalX 1.83进行多序列比对，再用MEGA 5.0进行邻接法（Neighbor-Joining）聚类系统发育分析［16］。1 000次（Bootstrap value）重复自检分析。各个种的代表序列均已提交到GenBank核酸序列数据库，并得到登录号KC708557～KC708575。

2 结果和分析

2.1 诺尼叶片中可培养内生菌的分离结果

通过分离纯化共得到诺尼叶片内生菌32株，利用测序分析和形态学观察方法，将其分为19种。其中霉菌2株，分为2种；细菌30株，分为17种。菌株形态描述见表1。

表1 诺尼叶片内生菌株的形态描述Tab.1 Morphological description of endophytes from Noni leaves samples

2.2 诺尼叶片中可培养内生菌的多样性分析

真菌分离结果中未得到酵母菌株，只分离到2种霉菌，各一株（NY1，NY2），分属于炭层菌属（Nemania sp.）和毛壳菌属（Chaetomium sp.），见表2。

共分离到30株细菌，通过构建系统发育树分为4支（见图2），隶属于4个门，7个属。其中厚壁菌门（Firmicutes）包括3个属，分别为芽孢杆菌属（Bacillus sp.），赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillus sp.），土地芽孢杆菌属（Terribacillus sp.）。变形菌门（Proteobacteria）包括2个属，为黄单胞菌属（Xanthomonas sp.）和肠杆菌属（Enterobacter sp.）。放线菌门（Actinobacteria）包括1个属，为微球菌属（Micrococcus sp.）。拟杆菌门（Bacteroidetes）包括1个属，为黄杆菌属（Flavobacterium sp.）。

表2 诺尼叶片中内生菌分离结果Tab.2 Isolation results of endophytes from Noni leaves samples

续表2

图2 基于16S rDNA序列构建的野生诺尼叶片内生细菌系统发育树Fig.2 16S rDNA phylogenetic tree of endophytes from Noni leaves samples

由表2可知，芽孢杆菌属为绝对优势属，分离率达66.7%，丰富度为55%；赖氨酸芽孢杆菌属次之，分离率为13.3%。优势种［17］有弯曲芽孢杆菌（Bacillus flexus），共6株，分离率为20%；蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus 3株，分离率为10%；解木糖赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus xylanilyticus）3株，分离率为10%。Bacillus methylotrophicus和Lysinibacillus macroides均为近年来发表的新种，Lysinibacillus macroides为中国新记录种［18-19］。

3 讨 论

植物内生菌是指生活史中某一阶段生活在植物组织内，对植物没有引起明显病害症状的一类微生物，可从经过严格表面消毒的植物组织分离得到。其具有固氮、促植物生长、增强宿主植物抗逆境、抗病虫害等作用，它们的代谢产物可能具有良好的药用价值，并可能与植物的药用价值密切相关［20］。

本文从野生诺尼叶片中共分离到可培养菌株32株，分离数量较少，原因可能如下1）本研究采用升汞表面灭菌的方法，升汞较强的腐蚀性可能会杀死部分内生菌株；2）诺尼本身具有抑菌活性，导致内生菌数量较少；3）在叶片和根等器官中内生菌含量原本就极少［20］。本研究分离鉴定结果显示诺尼叶片中的优势微生物为杆状细菌，其中芽孢杆菌属（Bacillus spp.）、赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillus spp.）为优势属，这与刘洋等诺尼种子内生细菌多样性研究结果相符［21］，且许多其他植物内生细菌的研究结果也都表明芽孢杆菌或产芽孢细菌常为优势菌属［22-24］，说明产芽孢细菌为一类非常重要的植物内生菌，值得进一步开发研究。本文中的优势种弯曲芽孢杆菌（Bacillus flexus）为重要的工业产碱性淀粉酶菌株；蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）可产生抗菌物质和细菌蛋白酶，可能与植物抵御病害能力有关；解木糖赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus xylanilyticus）为一种可降解木聚糖的菌株，且在猪笼草、香樟、夏枯草等药用植物内生细菌研究中均有分离。

内生菌作为一类重要的植物生存伴侣，在植物生长发育中起着重要的作用，往往容易被人们所忽视，目前许多植物内生菌研究在持续进行，得到了许多重要的发现。诺尼作为一种国际热销保健产品，内生菌与其药理活性关系值得研究，本文将为诺尼内生菌的研究开辟道路，奠定基础。

致 谢

本研究得到了海南省三沙市政府的大力支持与帮助，在此表示衷心地感谢！

［1］曹艳花，刘洋，姚粟，等.西沙野生诺尼内生细菌群落多样性初步研究［J］.食品科学技术学报，2014，32（2）：39-45.

［2］广东省植物研究所.海南植物志：第3卷［M］.北京：科学出版社，1974：330-331.

［3］Palu A K，Kim A H，West B J，et al.The effects of Morinda citrifolia L.（Noni）on the immune system：its molecular mechanisms of action［J］.J Ethnopharmacol，2008，12：115（3）：502-506.

［4］Wang M Y，West B，Jensen C J，et al.Morinda citrifolia（Noni）：a literature review and recent advances in Noni research［J］.Acta Pharmacol Sin，2002，23（12）：1127-1141.

［5］Yanine C，Fabrice V，Ana M P，et al.The Noni fruit：a review of agricultural research nutritional and therapeutic properties［J］.Journal of Food Composition and Analysis，2006，19：645-654.

［6］Akihisa T，Matsumoto K，Kimura Y，et al.Anti-inflammatory and potential cancer chemopreventive constituents of the fruits of Morinda citrifolia（Noni）［J］.J Nat Prod，2007，70（5）：754-758.

［7］Mohd Z，Abdul-Hamid A，Osman A，et al.Antioxidative activity of extracts from Mengkudu（Morinda citrifolia L.）root，fruit and leaf［J］.Food Chemistry，2001，78：227-231.

［8］Deng S，West B J，Palu A K，et al.Noni as an anxiolytic and sedative：a mechanism involving its gamma-aminobutyric acidergic effects［J］.Phytomedicine，2007，14（7-8）：517-522.

［9］Kim S W，Jo B K，Jeong J H，et al.Induction of extracellularma-trix synthesis in normal human fibroblasts by anthraquinone isolated from Morinda citrifolia（Noni）fruit［J］.J Med Food，2005，8（4）：552-555.

［10］Wang M Y，Anderson G，Nowicki D，et al.Hepatic protection by Noni fruit juice against CCl4-induced chronic liver damage in female SD rats［J］.Plant Foods Hum Nutr，2008，63（3）：141-145.

［11］Owen P L，Martineau L C，Caves D，et al.Consumption of guava（Psidium guajava L）and Noni（Morinda citrifolia L）may protect betel quid-chewing papua new guineans against diabetes［J］.Asia Pac J Clin Nutr，2008；17（4）：635-643.

［12］李法营，蓝增全，李青红，等.诺丽研究进展（一）［J］.安徽农业科学，2009，37（32）：15819-15821.

［13］张伟敏，魏静，刘四新，等.Noni果的活性成分和生理功能的研究进展［J］.天然产物研究与开发，2007，19：1087-1091.

［14］Van Wees S C，Pieteerse C M J，Trijssenaar A，et al. Differential induction of systemic resistance in arabidopsis by biocontrol bacteria［J］.Molecular Plant-Microbe Interactions，1997，10（6）：716-724.

［15］Jin S L，Kwan S K，Hack S J.Phylogenetic analysis of Xylaria based on nuclear ribosomal ITS1-5.8S-ITS2 sequences［J］.FEMS Microbiology Letters，2000，187：89-93.

［16］Saitou N，Nei M.The neighbor joining method，a new method for reconstructing phylogenetic trees［J］.Molecular Biology and Evolution，1987，4（4）：406-425.

［17］庞龙飞，尤民生.昆虫群落生态学［M］.北京：中国农业出版社，1996：77-103.

［18］Madhaiyan M，Poonguzhali S，Kwon S W，et al.Bacillus methylotrophicus sp.nov.，a methanolutilizing，plantgrowth-promoting bacterium isolated from rice rhizosphere soil［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2010，60（10）：2490-2495.

［19］Coorevits A，Dinsdale A E，Heyrman J，et al.Lysinibacillus macroides sp.nov.，nom.rev.［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2012，62（5）：1121-1127.

［20］文才艺，吴元华，田秀玲.植物内生菌研究进展及其存在的问题［J］.生态学杂志，2004，23（2）：86-91.

［21］刘洋，李辉，程池，等.西沙野生诺尼种子内生细菌群落多样性的初步研究［J］.生物技术通报，2013（10）：142-147.

［22］宋培勇，兰琴英，鲁卓越.南方红豆杉内生细菌分离鉴定及系统发育分析［J］.生物技术，2012，22（5）：61-65.

［23］宋培勇，李凤华，马莉莉.南方红豆杉内生细菌分离鉴定及系统发育分析［J］.微生物学通报，2011，38（1）：8-13.

［24］游玲，魏琴，张云等.山苍子（Litsea cubeba）可培养内生细菌的多样性［J］.西北农林科技大学学报，2012，40（4）：1-7.

Isolation and Identification of Endophytes in Wild Noni Leaves from Paracel Islands

BAI Feirong1， LIU Yang1，*， CAO Yanhua1， YAO Su1， LI Jinxia1
TAN Wangqiao2， CHENG Chi1，*
（1.China National Research Institute of Food and Fermentation Industies，China Center of Industrial Culture Collection，Beijing 100015，China；2.Hainan Noni Biological Engineering Development Co.Ltd.，Haikou 570125，China）

The diversity of culturable endophytes in wild Noni leaves from Paracel Islands was discussed in this study.Strains were isolated by using conventional tablet separation methods.The isolates were identified by the fungal internal transcribed spacer 1 and 2（ITS gene）amplification and the bacterial 16S rDNA amplification，combined with phylogenetic analysis.Total 32 endophytes were isolated and identified as 19 types.Two types of mold were Chaetomium sp.and Nemania sp.Seventeen types of bacteria（30 strains）belonged to 7 genera Bacillus sp.，which were Lysinibacillus sp.，Micrococcus sp.，Terribacillus sp.，Enterobacter sp.，Xanthomonas sp.，Flavobacterium sp.，and Bacillus sp..Bacillus sp.was the dominant genus among the endophytic bacte，which had 20 strains divided into 11 types.

Noni leaves from Paracel islands；endophytic bacteria；community diversity

李 宁）

TS201.3

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2015.01.006

2095-6002（2015）01-0032-06

白飞荣，刘洋，曹艳花，等.西沙野生诺尼叶片内生菌的分离与初步鉴定［J］.食品科学技术学报，2015，33（1）：32-37.

BAI Feirong，LIU Yang，CAO Yanhua，et al.Isolation and identification of endophytes in wild Noni leaves from Paracel islands［J］.Journal of Food Science and Technology，2015，33（1）：32-37.

2014-02-28

国家自然科学基金资助项目（31300008）；国家微生物资源平台专项（NIMR2014-4）；中国食品发酵工业研究院科技发展基金

（博士基金）项目（2012KJFZ-BS-01）；北京市科技新星计划项目（Z141105001814095）。

白飞荣，男，助理工程师，硕士，主要从事微生物分类学研究；

*程 池，男，教授级高级工程师，主要从事微生物学方面的研究。

。

*刘 洋，男，工程师，博士，主要从事微生物生态学方面的研究。

。