新生大鼠缺氧缺血性脑损伤HIF-1α和VEGF的表达及相关性分析

李 贞 顾镜月

新生大鼠缺氧缺血性脑损伤HIF-1α和VEGF的表达及相关性分析

李 贞 顾镜月

目的 建立新生大鼠缺氧缺血性脑损伤（HIBD）模型，研究HIBD时脑组织中HIF-1α和VEGF的表达及其相关性，为临床治疗提供实验依据。方法 7日龄新生Wistar大鼠112只，随机分为正常组，HIBD模型组。各组分别于规定时间点取脑组织，免疫组织化学方法检测HIF-1α和VEGF的阳性表达及其相关性。结果（1）HIBD模型组HIF-lα及VEGF阳性表达与正常组比较，差异均有统计学意义（P＜0．05）。（2）HIBD模型组HIF-1α 和VEGF的表达趋势一致，呈直线正相关（r=0．613，P＜0．01）。结论 HIF-1α 和VEGF在HIBD新生大鼠神经保护作用中起协同作用。

低氧诱导因子-1α；血管内皮生长因子；缺氧缺血性脑损伤

新生儿缺氧缺血性脑损伤（hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）是指各种围生期缺氧窒息引起的脑损伤，是新生儿死亡及远期运动智能落后、脑性瘫痪、癫痫等的主要原因之一[1]。研究表明，缺氧引起的凋亡主要由缺氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor 1，HIF-1）调节。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是唯一高度特异性的血管内皮细胞有丝分裂素，被认为是血管生成最直接、最重要的生长因子。缺氧是VEGF表达的强效因素之一。VEGF的基因启动子HIF-1α在低氧条件下处于激活状态，对VEGF的表达起直接诱导作用，从而促进血管新生及侧支循环的建立，发挥神经保护作用。本实验运用无氧法创建新生大鼠HIBD模型，研究HIF-1α和VEGF表达变化及相关性，揭示缺氧缺血性脑损伤发生机制，为临床寻找更有效的治疗方法提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验分组及动物模型的建立 选用佳木斯大学动物实验中心提供的健康7日龄Wistar大鼠112只，雌雄不限，体重15～20g，随机分为正常组，HIBD模型组，各56只。根据处死时间不同每组又分为 7个亚组：3h组、8h组、12h组、24h组、48h组、72h组、5d组，每个亚组8只。HIBD模型组参照无氧法[2]制备HIBD模型。

1.2 标本采集及免疫组织化学检测 分别于3h、8h、12、24h，3d及5d取各组动物乙醚麻醉，心脏灌注20 ml生理盐水，待流出液澄清，用4%多聚甲醛进行内固定，开颅取脑。于4%多聚甲醛、4℃固定24 h，脱水透明后石蜡包埋，于前囟前0.3mm至前囟后0.6mm连续切片，片厚5μm备用。标本采用免疫组化SABC法。阳性结果判定：取正常组、HIBD组各时间点免疫组化切片各3张。光学显微镜下观察大鼠海马区和皮层，取同一批次染色切片3个相应、不重复的视野，放大200倍，计数每个视野中阳性细胞数，取其平均值。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0统计学软件进行分析，采用t检验进行分析，各组数据用（±s）表示，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HIF-la免疫组化染色结果及统计学分析 脑组织HIF-lα阳性表达表现为神经细胞胞浆或胞核棕黄色细颗粒沉积，以大脑皮层及海马区阳性表达最为显著。正常组脑组织神经细胞仅见很少量HIF-lα阳性表达，各时间点差异无统计学意义（P＞0.05）。HIBD模型组脑组织HIF-lα阳性表达于造模后3h开始升高，但与正常组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；12h-24h阳性表达到达峰值，与正常组相比差异有统计学意义（P＜0.01），与HIBD模型组其它时间点比较，差异亦有统计学意义（P＜0.01）；48h后阳性表达逐渐下降，3-5d阳性表达仍有统计学意义（P＜0.05）。表1所示。

表1 二组大鼠（n=8）各时间点HIF-la阳性细胞表达（个/200倍视野）

2.2 VEGF免疫组化染色及统计学分析 脑组织VEGF阳性表达表现为神经细胞胞质中可见棕黄色细颗粒沉积，主要分布于大脑皮层及海马区。正常组脑组织神经细胞胞质中仅有极少量VEGF阳性表达，各时间点差异无显著性（P＞0.05）。HIBD模型组脑组织于造模后8h开始有少量VEGF阳性细胞表达，与正常组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；24-48h达高峰，与正常组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；3d后VEGF阳性细胞表达减少。表2所示。

2.3 HIF-1α和VEGF的相关性 绘制散点图对HIBD模型组HIF-lα和VEGF的相关性进行分析，结果发现HIF-lα和VEGF呈直线正相关（r=0.613，P＜0.01）。如图3所示。

3 讨论

表2 二组大鼠（n=8）各时间点VEGF阳性细胞表达（个/200倍视野）

图3 HIBD模型组HIF-lα和VEGF表达的相关性

核转录因子HIF-1是低氧诱导因子蛋白家族（HIFs）中维持细胞氧稳态的主要分子，由一个β结构性亚基和一个α功能性亚基构成，α亚基的表达有赖于细胞内的氧浓度。低氧条件下，HIF-1可诱导PI3K/Rho/ROCK途径激活c-myc，使其与myc-max反应元件结合，促进VEGF转录从而促进血管形成；还可促进GLUT-1，ENO-1，EPO等基因的表达，抑制凋亡。Baek等[3]发现VEGF是缺氧时HIF-1最重要的靶基因之一。研究表明，HIF-1α缺失可导致VEGF表达下降，抑制肿瘤新生血管的形成，降低细胞对缺氧的耐受性，增加细胞凋亡。本研究发现各时间点模型组HIF-1α阳性表达均高于正常组，海马及皮质区尤其是血管内皮细胞表达明显增强。神经元在海马及皮质区分布较集中，对缺氧缺血较敏感。缺氧缺血脑损伤后，可能通过增加HIF-1α 的表达，激活 PI3K/Rho/ROCK途径[4]，促进VEGF转录，促进血管形成，使细胞、组织对低氧环境发生适应性和保护性改变，抵抗细胞凋亡，为神经修复提供条件。本研究仅揭示缺氧缺血性脑病可能的发病机制，临床实践中应用何种治疗手段能促进脑组织中积极因子的表达，从而提高缺氧缺血性脑病患儿的临床疗效及预后有待进一步研究。

[1]Jiang W,Chen L,Zhang XJ,Chen J,Li XC,Hou WS,et al．Red photon treatment inhibits apoptosis via regulation of bcl-2 proteins and ROS levels,alleviating hypoxic-ischemic brain damage[J]．Neuroscience,2014,268:66-74．

[2]莫国梁,余加林．新生儿缺氧缺血性脑病动物模型的建立[J]．儿科药学杂志,2008(02):58-60．

[3]Park HJ,Baek KH,Lee HL,Kwon A,Hwang HR,Qadir AS,et al．Hypoxia inducible factor-1alpha directly induces the expression of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand in periodontal ligament fibroblasts[J]．Mol Cells．2011,31(6):573-8．

[4]Mizukami Y,Fujiki K,Duerr EM,Gala M,Jo WS,Zhang X,et al．Hypoxic regulation of vascular endothelial growth factor through the induction of phosphatidylinositol 3-kinase/Rho/ROCK and c-Myc[J]．J Biol Chem,2006,281(20):13957-63．

THE EXPRESSION OF HIF-1AIN AND VEGF IN HYPOXIA ISCHEMIA BRAIN DAMAGE IN NEONATAL RATS

Li Zhen1Gu Jingyue2
(1Anyang city maternal and child health care and children's hospital,455000；2Jiamusi university first affiliated hospital，154002)

Objective To investigate the expression of HIF-1ain and VEGF in Hypoxia Ischemia Brain Damage in neonatal rats.Methods A total of 112 female or male Wistar rats aged 7 days were randomly divided into three groups:normol group and HIBD model group.HIBD model of neonatal rats were established in HIBD model group.Rats in three groups were sacrificed at different time points and brain tissue were collected.Then morphologic changes of brain tissue in general obtained through macroscopic observation,the brain tissue were HE stained to observe the pathological changes under light microscope.The expression of HIF-1αand VEGF in hippocampa was detected with the immunohistochemistry method.Results（1）In the Hypoxia Ischemia Brain Damage model,the expression of HIF-1α and VEGF positive cells compared with the normol group(P＜0.05).（2）The expressions of HIF-1αand VEGF in brain tissue in HIBD had notable positive correlation(r=0.613,P＜0.01).Conclusion The expressions of HIF-1α and VEGF in brain tissue in HIBD and rhG-CSF treatment group had notable positive correlation.

Hypoxia inducible factor-1α ；Vascular endothelial growth factor；Hypoxia ischemia brain injury

作者单位：455000安阳市妇幼保健院暨儿童医院（李贞）；154002 佳木斯大学第一附属医院（顾镜月）

R722．1

B