左旋多巴对马尔尼菲青霉黑素合成以及药敏的影响

彭程 孙弦 刘栋华

·论著·

左旋多巴对马尔尼菲青霉黑素合成以及药敏的影响

彭程 孙弦 刘栋华

目的 探讨左旋多巴对马尔尼菲青霉黑素合成的影响及黑素化是否影响马尔尼菲青霉对抗真菌药的敏感性。方法 将马尔尼菲青霉临床分离株GXMU121011分别接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基37℃培养7 d，观察左旋多巴不同浓度（0.1～10.0 mmol/L）和马尔尼菲青霉不同接种密度（1.0×105～1.0×107cfu/ml）对马尔尼菲青霉黑素生成的影响。用纸片法进行体外抗真菌药敏试验，分别测定伊曲康唑、氟康唑和两性霉素B对8株马尔尼菲青霉菌株在含左旋多巴和不含左旋多巴培养时的抑菌圈大小。结果 左旋多巴浓度由0.1 mmol/L增加至1.0 mmol/L时，马尔尼菲青霉菌落变黑程度随之增加；左旋多巴浓度处在1.0 mmol/L或3.0 mmol/L时，菌落最黑，左旋多巴浓度继续增加时菌落黑化程度减轻，左旋多巴浓度在10.0 mmol/L时菌体出现轻微皱缩的现象。菌落颜色随着接种菌密度的逐渐升高而加深。伊曲康唑、两性霉素B和氟康唑对含左旋多巴培养的马尔尼菲青霉抑菌圈平均直径均显著小于不含左旋多巴培养的马尔尼菲青霉（P＜0.05）。结论 左旋多巴的浓度和接种菌落的密度影响马尔尼菲青霉黑素的生成。黑素化培养可以降低酵母相马尔尼菲青霉对伊曲康唑、氟康唑和两性霉素B的敏感性。

马尔尼菲青霉；黑素；左旋多巴；抗真菌药

马尔尼菲青霉（Penicillium marneffei，PM）是青霉菌属中唯一具有温度双态性的真菌，25℃呈菌丝相生长，37℃呈酵母相生长，酵母相为致病相。马尔尼菲青霉病（penicilliosis marneffei，PSM）是由PM感染引起的一种少见深部真菌病，本病可为局限性感染，更多为播散性感染；多发生于有免疫功能缺陷者，也有报道发生于免疫功能正常者［1］。黑素是一类广泛存在于植物、动物以及微生物中的深褐色至黑色大分子化合物，研究发现，多种致病性真菌，如，烟曲霉、申克孢子丝菌等产生的黑素能增强真菌的毒力，其机制包括抗氧化、抗溶酶体、耐受抗真菌类药物等［2］。本课题组前期［3］研究证实，PM 在体外可以利用左旋多巴合成黑素。2005年，Youngchim等［4］证实，体外PM可以合成黑素或黑素样化合物，使用抗烟曲霉黑素的抗体可以检测到感染PM的小鼠血清中以及1例患者皮损组织中有黑素，研究结果提示，PM在人体内可以利用左旋多巴或L酪氨酸等底物合成黑素，从而增强其自身逃避宿主免疫杀伤的能力，但其确切的性质及机制尚不明确。本实验通过培养观察不同浓度的左旋多巴和不同接种菌落密度对PM黑素生成的影响，使用纸片法进行体外抗真菌药敏试验，探讨黑素化对PM抗真菌药物的敏感性是否有影响。

资料与方法

一、材料

1.菌株来源：马尔尼菲青霉菌株8株，其中1株马尔尼菲青霉标准株FRR2161（澳大利亚墨尔本大学AlexAndromopolous教授惠赠）；其余7株临床患者分离株（GXMU08018、GXMU121011、GXMU130122、GXMU110601、GXMU10844、GXMU111230、GXMU 080122）系广西医科大学第一附属医院皮肤性病科真菌室保存；实验质控菌株采用近平滑念珠菌（ATCC22019）。

2.主要试剂和仪器：左旋多巴购于美国Sigma公司，天门冬酰胺购于上海生工生物工程技术服务有限公司，琼脂粉、葡萄糖购于上海化学试剂公司，蛋白胨购于英国Oxoid公司，真菌药敏片购于温州市康泰生物科技有限公司。

二、方法

1.不同浓度的左旋多巴对PM产黑素的影响①配制含不同左旋多巴浓度的沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）平皿，依次为 0.1、1.0、3.0、6.0、10.0 mmol/L设空白对照组不加左旋多巴；②将PM临床分离株GXMU121011酵母相细胞菌悬液接种于平皿中③倒扣平皿，置于37℃恒温箱避光培养7 d，观察菌落颜色的变化。

2.左旋多巴浓度一定时不同菌接种密度对PM产黑素的影响：①制备含1.0 mmol/L左旋多巴的SDA平皿，设空白对照组不加左旋多巴；②将PM临床分离株GXMU121011酵母相细胞菌悬液用血细胞计数板计数，调整密度分别为1.0×105、1.0×1061.0×107cfu/ml；③分别吸取各浓度菌悬液200 μl于平皿中；④用无菌涂布棒涂匀；⑤37℃温箱倒置避光培养7 d，观察菌落颜色。

3.黑素化后的PM体外药敏试验：①真菌药敏纸片的准备：伊曲康唑 8 μg，氟康唑 15 μg，两性霉素B10 μg；②制备含1.0 mmol/L左旋多巴的SDA平皿为实验组；不含左旋多巴的SDA平皿为对照组；③将PM酵母细胞菌悬液调至1.0个麦氏浓度④用无菌棉拭子蘸取适量上层液体，均匀涂布在培养基表面；⑤待平皿上的水分被琼脂完全吸收后用无菌眼科镊子取药敏纸片贴上；⑥37℃培养48～96 h，测量并记录抑菌圈直径。

图1 马尔尼菲青霉（GXMU121011）在含不同浓度左旋多巴的SDA生长7 d，可见不含左旋多巴培养的菌落呈淡黄色；左旋多巴浓度由0.1 mmol/L增至1.0 mmol/L时，PM菌落变黑程度随之增加；左旋多巴浓度在1.0 mmol/L或3.0 mmol/L时菌落最黑，而左旋多巴浓度由3.0 mmol/L增至10.0 mmol/L时菌落颜色逐渐变浅

图2 不同马尔尼菲青霉（GXMU121011）接种密度在含/不含1.0 mmol/L左旋多巴的SDA生长7 d，接种密度由1.0×105cfu/ml增至1.0×107cfu/ml，含左旋多巴培养的菌落颜色逐渐加深（图2上排），不含左旋多巴（图2下排）颜色无明显改变

4.统计方法：所测得的结果经过统计软件SPSS 16.0进行分析，采用配对t检验比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、不同浓度左旋多巴对PM产黑素的影响

左旋多巴浓度由0.1 mmol/L增加至1.0 mmol/L时，PM菌落变黑程度随之增加；左旋多巴浓度在1.0 mmol/L或3.0 mmol/L时，菌落最黑，左旋多巴浓度继续增加时菌落黑化程度减轻，左旋多巴浓度在10.0 mmol/L时菌体出现轻微皱缩的现象，见图1。

二、接种菌密度对PM产黑素的影响

PM在含1.0 mmol/L左旋多巴的SDA培养，菌落颜色随着接种菌密度的逐渐升高而加深，对照组（即不含左旋多巴培养）颜色无明显改变（图2）。

三、体外药敏试验结果

8株PM菌株在含/不含1.0 mmol/L左旋多巴的SDA平皿中37℃培养，48～96 h后测得伊曲康唑，氟康唑和两性霉素B对PM抑菌圈平均直径依次为：伊曲康唑26.88 mm±1.81 mm（对照组34.13 mm±1.81 mm）；氟康唑19.50 mm±6.46 mm（对照组25.87mm±7.34mm）；两性霉素B，17.13mm±2.59mm（对照组22.25 mm±4.80 mm）；含左旋多巴和不含左旋多巴培养（即对照组）两组比较差异均有统计学意义（t值依次为 13.781，8.728，4.163，均 P ＜0.05）。3种抗真菌药质控结果均在质控范围内，伊曲康唑24 mm（不含左旋多巴28 mm）；氟康唑36 mm（不含左旋多巴38 mm）；两性霉素B 25 mm（不含左旋多巴20 mm）。

讨 论

本课题前期［3］研究用含或不含1.0 mmol/L左旋多巴的基础培养基和脑心浸膏培养基培养酵母相PM，透射电镜观察其细胞壁内侧面有密集排列的电子致密颗粒，直径约100 nm，分离菌体色素颗粒经电子自旋共振等方法证实PM在体外能利用左旋多巴合成黑素［5］。新生隐球菌［6］、巴西副球孢子菌［7］等相关文献是用1.0 mmol/L左旋多巴进行黑素化诱导，酵母相PM黑素化最适合的左旋多巴浓度待确定。本研究实验结果提示，最适合诱导PM合成黑素浓度为1.0～3.0 mmol/L，左旋多巴继续增加时PM黑素产生并不增加，菌落生长可能还受到抑制。因此，药敏试验中，我们采用左旋多巴浓度为1.0 mmol/L作为诱导PM黑素化培养。用含同样浓度左旋多巴的培养基，接种菌密度越大菌落颜色越深，黑化程度增高，其机制可能为微生物的群体感应效应，这在新生隐球菌有同样的现象［8］。通常PM在25℃产生红色素，而37℃不产生红色素而成白色菌落，同时PM细胞的形态还与培养基的成分相关，本研究采用SDA，37℃PM在SDA上生长，PM细胞并不完全表现为酵母样细胞，少部分为短棒状菌丝体，在37℃SDA培养部分菌落产生少许红色素，此现象主要出现在低密度（1.0×105cfu/ml）接种，较高密度接种（1.0×107cfu/ml）的菌落无此现象，提示PM在形成酵母细胞的生长过程中同样存在着群体感应效应。

黑素作为真菌毒力因子之一，其作用主要体现在增强病原体抵抗宿主氧化杀伤方面，黑素对病原体抵抗抗真菌药物是否有影响？van Duin等［9］报道用大量肉汤稀释法检测新生隐球菌和荚膜组织胞浆菌对抗真菌药的敏感性，结果为黑素化和未黑素化的两种菌对两性霉素B、卡泊芬净、氟康唑、伊曲康唑和氟胞嘧啶差异均无统计学意义，而用时间杀菌实验方法检测结果为黑素化的这两种菌株在两性霉素B、卡泊芬净敏感性比未黑素化的有减弱，但在氟康唑、伊曲康唑和氟胞嘧啶没有差异。de Fatima Lisboa Fernandes 等用微量肉汤稀释法［6］，Ikeda等［10］用微量肉汤稀释法和时间杀菌实验检测新生隐球菌对两性霉素B和伏立康唑的敏感性，结果为黑素化比未黑素化的新生隐球菌对两性霉素B敏感性减弱，而对伏立康唑无差异。本研究用伊曲康唑，氟康唑和两性霉素B 3种抗真菌药物纸片扩散法行体外药敏试验，黑素化比非黑素化平皿的抑菌圈直径均减少，差异有统计学意义（P＜0.05），提示黑素化的PM对以上3种抗真菌药的敏感性下降，与上述文献报道的不完全一致，考虑实验方法、菌种、菌株对药敏试验有影响。研究发现，新生隐球菌的黑素沉积在细胞壁，两性霉素B和卡泊芬净与黑素预孵化后，黑素C：N：O比例发生了变化，提示黑素与AMB和卡泊芬净结合，阻止AMB到达作用部位，但是唑类抗真菌药黑素C：N：O比例没有变化［10-11］。两性霉素B直接与敏感真菌细胞膜上的麦角甾醇结合，损伤膜的通透性；唑类抗真菌药与真菌细胞色素P450发生交互作用，阻断去甲基化过程，间接抑制真菌细胞膜麦角固醇的生物合成。我们推测PM黑素能够增强细胞壁稳定性，减弱抗真菌药进入细胞膜及细胞质，从而降低对抗真菌药物的敏感性。在新生隐球菌感染小鼠模型试验中，除草剂glyphosphate能降低新生隐球菌黑素水平并延长小鼠生存时间［12］，提示在临床治疗中可以在使用抗真菌药的基础上联合抑制PM黑素形成的药物可能会增加PM对抗真菌药的敏感性。

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Effect of levodopa on melanogenesis in and antifungal drug susceptibility ofPenicillium marneffei

Peng Cheng,Sun Xian,Liu Donghua.Department of Dermatology and Venereology,First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021,China

ObjectiveTo investigate the effectoflevodopa onmelanogenesisinPenicillium marneffei（PM）,and to determine if melanization affects the antifungal drug susceptibility of PM.MethodsA clinical isolate of PM,GXMU121011,wasinoculatedontoSabouraud′sdextroseagar（SDA）containingdifferentconcentrations（0.1-10mmol/L）of levodopa at an inoculum density of 1.0×106cfu/ml,or onto SDA containing 1 mmol/L levodopa at three inoculum densities（1.0×105,1.0×106,1.0×107cfu/ml）,and cultured at 37℃for 7 days.Subsequently,melanization of PM colonies was observed.The paper-disk method was used for antifungal susceptibility testing,and the diameter of inhibition zones of itraconazole,fluconazole and amphotericin B against 8 clinical strains of PM was determined on SDA with or without levodopa.ResultsThe melanization of PM colonies increased when the concentration of levodopa increased from 0.1 to 1.0 mmol/L,peaked when that reached 1.0 and 3.0 mmol/L,but mildly decreased when that continuously increased beyond 3.0 mmol/L,and a slight shrinkage was observed in PM colonies when that was 10.0 mmol/L.The color of colonies deepened along with the increase in inoculum density of PM.The average diameters of inhibition zones of itraconazole,fluconazole and amphotericin B against PM were all significantly lower on SDA with levodopa than on SDA without levodopa（allP＜0.05）.Conclusions Levodopa concentration and inoculum density both affect melanogenesis in PM.Melanization may decrease the susceptibility of PM in yeast phase to itraconazole,fluconazole and amphotericin Bin vitro.

Penicillium marneffei;Melanins;Levodopa;Antifungal agents

Liu Donghua,Email:ldhgxmu@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.02.014

国家自然科学基金（81160191）

530021南宁，广西医科大学第一附属医院皮肤性病科

刘栋华，Email：ldhgxmu@163.com

2014-03-30）

（本文编辑：吴晓初）