氨基酮戊酸光动力疗法诱导中波紫外线应激性衰老成纤维细胞发生凋亡

张丽超 张海荣 周炳荣 骆丹 马立文 张家安 王申 易飞 Maya Valeska Gozali刘娟

·论著·

氨基酮戊酸光动力疗法诱导中波紫外线应激性衰老成纤维细胞发生凋亡

张丽超 张海荣 周炳荣 骆丹 马立文 张家安 王申 易飞 Maya Valeska Gozali刘娟

目的 研究氨基酮戊酸光动力疗法（ALA-PDT）对中波紫外线（UVB）应激性衰老成纤维细胞（UVB-SIPS-FB）的氧化损伤和凋亡作用。方法 正常成纤维细胞及UVB-SIPS-FB均分为2 h和6 h孵育组，每组内再分为7组：对照组、ALA组、100 J/cm2照光组、3组不同红光照射剂量ALA-PDT处理组（25 J/cm2组、50 J/cm2组、100 J/cm2组）及抗氧化剂NAC+50 J/cm2红光照射ALA-PDT处理组。采用635 nm红光（能量密度50 mW/cm2）照射处理后，使用荧光显微镜、流式细胞仪检测各组细胞中活性氧及线粒体膜电位水平；Hoechst染色、流式细胞仪检测细胞凋亡率。数据用SPSS 13.0软件分析，多组间均数行单因素方差分析，结合q检验。结果 孵育2 h，25、50、100 J/cm2ALA-PDT组UVB-SIPS-FB凋亡率（分别为7.34%±0.87%、8.39%±1.16%、17.03% ±1.29%）较对照组（3.81% ±0.59%）上升（F=102.70，均 P＜0.05），NAC+50 J/cm2ALA-PDT组凋亡率（5.35%±0.58%）下降（P＜0.05）；孵育 6 h，25、50、100 J/cm2ALA-PDT组UVB-SIPS-FB 凋亡率（分别为 13.85%±1.71%、23.40% ±2.14%、41.02% ±2.73%）较对照组（5.09% ±1.64%）显著上升（F=106.00，均 P＜0.05），NAC+50 J/cm2ALA-PDT组凋亡率（9.97%±3.23%）显著下降（P＜0.05）。单纯ALA组或照光组UVB-SIPS-FB凋亡率与对照组差异均无统计学意义。ALA-PDT处理组细胞活性氧荧光强度显著上升，线粒体去极化增强，这些现象与ALA孵育时间及红光照射剂量均呈量效依赖性关系。使用抗氧化剂NAC预处理可以减少ALA-PDT诱导的活性氧增多及线粒体去极化增强，与凋亡率变化一致。结论 ALA-PDT可诱导UVB-SIPS-FB出现明显的细胞凋亡，其作用机制可能与ALA-PDT对细胞的氧化损伤有关。

氨基酮戊酸；紫外线；成纤维细胞；细胞衰老；光化学疗法；氧化性应激；细胞凋亡

皮肤光老化主要由日光中的紫外线长期照射引起，表现为皮肤曝光部位出现不规则色素斑、深皱纹、毛孔粗大、毛细血管扩张以及皮肤松弛等。Varani等［1］发现，光老化皮肤中正常成纤维细胞（FB）数目减少，代之以老化FB，细胞合成胶原能力降低，基质降解成分增多，导致皮肤松弛，出现皱纹。近年临床证明，氨基酮戊酸光动力疗法（aminolevulinic acid photodynamic therapy，ALAPDT）具有嫩肤效应，可用于治疗皮肤光老化［2-4］。Park 等［5］发现，ALA-PDT 能使表皮厚度减少，真皮胶原增加。一般认为，ALA-PDT治疗的原理为外敷ALA吸收后在组织内转化成光敏剂原卟啉IX（PpIX），特定波长激光照射后，产生大量活性氧簇（ROS），调节细胞脂质过氧化和血管反应，产生直接或间接的细胞毒性效应，造成病变细胞凋亡［6］。鉴于光老化FB在皮肤光老化中的重要作用，本实验以中波紫外线（UVB）诱导的衰老FB（UVB-SIPS-FB）作为光老化细胞模型，间接探讨ALA-PDT对光老化皮肤FB的影响。

材料和方法

一、细胞培养、试剂和仪器

人皮肤成纤维细胞（HSF）取自成年健康男性包皮组织。37℃，5%CO2条件下用含10%小牛血清的DMEM培养基培养。取5～10代对数生长期细胞进行实验，细胞每天换液1次；UVB照射组每次照射前用磷酸盐缓冲液（PBS）替换培养基，照射后换含1%小牛血清的DMEM培养基继续培养。连续培养5 d，每日1次照射UVB，培养板距灯管15 cm，每次剂量为10 mJ/cm2，总剂量为50 mJ/cm2，剂量设置参照文献［7］。

ALA粉剂（118mg/瓶，上海复旦张江生物医药有限公司），细胞凋亡检测试剂盒（美国BD公司），CCK-8试剂盒、ROS检测试剂盒、NAC抗氧化剂、罗丹明123、细胞凋亡-Hoechst染色试剂盒（上海碧云天生物技术研究所）；SS-04P型UVB台式紫外线光疗仪及UVB辐照度监视器（上海希格玛高技术有限公司）；XD-635AB型光动力激光治疗仪（波长635 nm，上海复旦张江生物医药股份有限公司）。

二、荧光显微镜观察

将密度约为2×105/ml正常FB及UVB-SIPS-FB接种于6 cm培养皿培养24 h，去除细胞培养液，PBS漂洗3遍。正常FB及UVB-SIPS-FB均分为2 h和6 h孵育组，每组内再分为7组：对照组（无ALA无红光照射）、ALA组（单纯ALA孵育，无红光）、100 J/cm2照光组（单纯红光，无ALA）、3组ALAPDT 处理组（25 J/cm2组、50 J/cm2组、100 J/cm2组）及NAC组（ALA孵育后于照光前1 h加入5 mmol/L NAC，再予50 J/cm2红光照射）。ALA溶液为现配的1 mmol/L ALA+DMEM培养液，按上述分组分别避光培养2 h或6 h后，弃去培养液，PBS漂洗3遍，加入1 ml PBS防止干涸，采用635 nm红光照射，距离细胞10 cm，功率50 mW/cm2，光照后弃去原培养液，PBS洗3遍，吸尽液体，严格按照说明书要求进行以下各项检测。

1.ROS检测：采用原位装载探针的方法，以1∶1 000比例稀释相应探针，每皿加入1 ml稀释液，37℃避光孵育20 min。用PBS洗涤细胞3次，荧光显微镜下观察并拍照。

2.线粒体膜电位（MMP）检测：采用罗丹明123染色法，每皿加入1 ml稀释液，终浓度为1 μmol/L，37℃避光孵育30 min。用PBS洗涤细胞3次，荧光显微镜下观察并拍照。

3.Hoechst染色观察凋亡细胞形态变化：加入0.5 ml固定液，10 min后去固定液，PBS洗2遍，加入0.5 ml Hoechst 33258染色液染色5 min。去染色液，PBS洗2遍，吸尽液体，荧光显微镜下观察并拍照。

三、流式细胞仪定量检测

将密度约为5×106/ml细胞接种于10 cm培养皿中培养贴壁。上述分组后各加入培养液10 ml，避光培养6 h后，弃去培养液，PBS漂洗3遍，加入5 ml PBS防止干涸，采用635 nm红光，距离细胞10 cm，照射功率密度50 mW/cm2，光照后弃去原培养液，PBS洗3遍，吸尽液体，消化离心收集细胞于15 ml离心管中，根据上述染色方法，分别上机检测细胞ROS、MMP的平均荧光强度。激发波长设为488 nm，发射波长设为525 nm。

Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡率：分别用100 μl的标记溶液重悬各组收集的细胞，室温下避光孵育15 min，离心收集细胞并去上清。加入荧光（SA-FLOUS）溶液4℃下孵育20 min，避光并不停振动，上机检测，计算Annexin V和PI双标的细胞分群作为凋亡细胞。

四、统计学分析

使用SPSS 13．0软件对实验数据进行分析，采用单因素方差分析，结合q检验，P＜0.05认为差异有统计学意义。

结 果

一、细胞内ROS、MMP的变化

ALA孵育2 h或6 h，正常FB及UVB-SIPS-FB两种细胞ALA-PDT组ROS、MMP荧光强度均高于各自对照组（P ＜ 0．05），加入 NAC 后，荧光强度降低，与各自50 J/cm2ALA-PDT组差异有统计学意义（P＜0.05）；ALA组及100 J/cm2照光组与对照组相比，差异均无统计学意义（P ＞ 0．05）。

ALA孵育2 h后予红光照射，正常FB及UVBSIPS-FB两组内25 J/cm2与50 J/cm2ALA-PDT组之间差异均无统计学意义（P＞0.05），当光照强度增至100 J/cm2，两组内ROS、MMP荧光强度均较50 J/cm2时增大（P ＜ 0.05）；光照强度为 50 J/cm2，UVB-SIPSFB组细胞内ROS低于正常FB组（P＜0.05）；光照强度为 25 J/cm2或 100 J/cm2，正常 FB和 UVBSIPS-FB组细胞内ROS差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 1。

ALA孵育6 h后予红光照射，随着照光剂量增大，正常FB及UVB-SIPS-FB组细胞内ROS、MMP荧光强度均较各自对照组有升高；相同照光剂量下，正常FB组细胞内ROS、MMP荧光强度均高于UVB-SIPS-FB组，差异有统计学意义（P＜0．05）。见表1。

同一照光剂量下，正常FB或UVB-SIPS-FB组内，6 h ALA孵育组细胞内ROS、MMP水平均高于各自2 h孵育组（P＜0.05）。见表1。

二、ALA-PDT对细胞凋亡的影响

荧光显微镜下，对照组与ALA组及100 J/cm2照光组Hoechst染色细胞核呈均匀淡染蓝色，ALAPDT组观察到呈致密浓染的凋亡细胞核，且随着ALA孵育时间延长、光照剂量增加，细胞凋亡特征越明显，比例也越高；加入NAC后，细胞凋亡受到抑制。孵育6 h ALA-PDT组可见凋亡细胞显著增多，细胞核染色质固缩明显，呈致密浓染。见图1。

流式细胞仪结果显示，正常FB及UVB-SIPS-FB在ALA-PDT组凋亡率均高于各自对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；加入NAC后，凋亡率下降。与对照组相比，ALA组、100 J/cm2照光组差异无统计学意义（P＞0．05）。ALA孵育正常FB及UVBSIPS-FB 2 h后予红光照射，光照强度为25 J/cm2或50 J/cm2，两种细胞差异均无统计学意义（P＞0.05）；当增至100 J/cm2，两种细胞凋亡率均较50 J/cm2时上升（P＜0.05）。ALA孵育6 h后予红光照射，随着照光剂量增大，正常FB及UVB-SIPS-FB细胞凋亡率均上升；相同照光剂量下，正常FB组细胞凋亡率均高于UVB-SIPS-FB组，差异有统计学意义（P＜0．05）。同一照光剂量下，正常FB或UVB-SIPS细胞组内，6 h ALA孵育组细胞细胞凋亡率均高于各自2 h孵育组（P＜0.05）。见表1。

表1 氨基酮戊酸（ALA）孵育2和6 h后成纤维细胞活性氧及线粒体膜电位平均荧光强度和成纤维细胞凋亡率（±s）

表1 氨基酮戊酸（ALA）孵育2和6 h后成纤维细胞活性氧及线粒体膜电位平均荧光强度和成纤维细胞凋亡率（±s）

注：n=3。FB：成纤维细胞；UVB-SIPS-FB：中波紫外线诱导的衰老成纤维细胞；ALA-PDT：氨基酮戊酸光动力疗法。F值为25、50、100 J/cm2 ALA-PDT组、对照组比较的结果。a：与对照组相比，P＜0.05；b：与同一光照强度的UVB-SIPS-FB相比，P＜0.05；c：与50 J/cm2ALA-PDT组相比，P＜0.05

组别 活性氧 线粒体膜电位 成纤维细胞凋亡率（%）正常FB UVB-SIPS-FB 正常FB UVB-SIPS-FB 正常FB UVB-SIPS-FB孵育2 h对照组 0.42±0.44 0.71±0.57 0.18±0.12 ALA组 0.23±0.15 0.78±0.66 0.14±0.19 100 J/cm2照光组 0.16±0.20 0.85±0.52 0.09±0.15 25 J/cm2ALA-PDT组 6.58±1.52a 4.84±0.53a 6.16±0.78a 50 J/cm2ALA-PDT组 10.41±2.27ab 5.22±0.66a 6.62±1.26a 100 J/cm2ALA-PDT组 20.85±2.89ac 18.53±0.68ac 23.36±2.56ac NAC+50 J/cm2ALA-PDT组 0.20±0.13c 1.01±0.50c 0.31±0.25c F值 80.77 356.70 170.60 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05孵育6 h对照组 0.01±0.01 0.02±0.02 0.26±0.25 ALA组 0.02±0.02 0.02±0.03 0.56±0.93 100 J/cm2照光组 0.05±0.07 0.04±0.06 0.29±0.42 25 J/cm2ALA-PDT组 20.23±1.66ab 12.87±2.46a 18.41±1.14ab 50 J/cm2ALA-PDT组 35.75±2.17ab 23.41±2.12a 37.51±1.75ab 100 J/cm2ALA-PDT组 62.13±1.90ab 51.70±1.48a 50.44±1.82ab NAC+50 J/cm2ALA-PDT组 8.33±0.95c 6.25±1.66c 4.77±1.19bc F值 972.60 487.20 863.30 0.23±0.32 0.16±0.11 0.18±0.11 4.75±0.70a 4.42±1.06a 19.35±1.97ac 0.20±0.18c 181.70＜0.05 3.23±0.65 3.61±1.32 2.94±0.72 9.92±1.41a 10.20±1.36a 17.35±0.96a 6.29±1.02c 68.33＜0.05 3.81±0.59 4.07±0.58 4.41±0.78 7.34±0.87a 8.39±1.16a 17.03±1.29a 5.35±0.58c 102.70＜0.05 0.14±0.09 0.19±0.27 0.33±0.30 16.18±0.68a 25.17±0.90a 41.08±1.99a 5.14±1.31c 738.40 5.17±1.27 3.63±0.82 4.73±1.02 18.62±1.44ab 31.31±2.21ab 51.37±3.43ab 9.09±2.20c 249.50 5.09±1.64 4.50±1.08 3.63±2.72 13.85±1.71a 23.40±2.14a 41.02±2.73a 9.97±3.23c 106.00 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

图1 Hoechst染色观察氨基酮戊酸（ALA）孵育2 h或6 h后，成纤维细胞凋亡的形态变化（× 100） 1A：对照组；1B：ALA组；1C：100 J/cm2照光组；1D ～1G：分别为ALA孵育2 h的25、50、100 J/cm2ALA光动力疗法1I 1J 1K（ALA-PDT）组和NAC+50 J/cm2ALA-PDT组；1H～1K：分别为ALA孵育6 h的25、50、100 J/cm2ALA-PDT组和NAC+50 J/cm2ALA-PDT组。对照组与ALA组、100 J/cm2照光组Hoechst染色细胞核呈均匀淡染蓝色，ALA-PDT组观察到呈致密浓染的凋亡细胞核，且随着ALA孵育时间延长、光照剂量增加，细胞凋亡比例越高，特征也越明显；加入NAC后，可明显抑制细胞凋亡。孵育6 h ALA-PDT组较2 h组凋亡细胞显著增多，细胞核染色质固缩明显，呈致密浓染

讨 论

皮肤衰老反映在细胞水平即为细胞衰老，而FB是皮肤真皮中最主要的细胞类型，光老化FB可发生线粒体DNA突变累积，细胞内超氧化物歧化酶、GPx、抗坏血酸及谷胱甘肽等抗氧化成分显著减少，清除氧自由基保护皮肤的能力下降［8］，这些特征性的结构、功能改变是皮肤光老化形成的最重要基础。吕婷等［9］认为，光动力的选择性剥脱作用使老化细胞发生不同程度的凋亡、坏死和剥脱，最终皮肤通过去除老化变性的组织而变得平滑；而Jang等［10］发现，低剂量 PDT（3～ 10 J/cm2）作用，可产生少量增多的ROS，引起光老化FB增生及活力增强，从而改善老化组织。立足以上两点，本研究证实了ALAPDT的光动力损伤效应，并初步探讨其可能的氧化损伤机制。

正常细胞内ALA合酶催化琥珀酰CoA和谷氨酸盐合成ALA，经代谢再合成PpIX，如不给予光照，PpIX会在24～48 h内转化成非光活性的亚铁血红素［11］，最终形成血红素。若以外源性ALA孵育细胞，细胞可吸收ALA合成PpIX，此时再予合适波长激光照射，将发生一系列光化学反应，诱导细胞凋亡。人细胞吸收ALA的机制尚不明确，原卟啉合成在增生快速的细胞如癌变及癌前细胞里明显增多，皮肤肿瘤细胞是周围组织的10倍左右，慢性光损伤细胞对ALA也有很好的通透性［12］。我们的前期研究发现，1 mmol/L ALA孵育成纤维细胞0～6 h，激光共聚焦显微镜观察到正常及UVB-SIPS-FB细胞内PpIX平均荧光强度逐渐增高，5 h内，两种细胞无明显差别，6 h开始，正常FB胞内PpIX平均荧光强度较UVB-SIPS-FB明显增加（P＜0.05），故本实验分别选择ALA孵育2 h、6 h进行比较研究。

本研究证实，ALA-PDT可以诱导光老化细胞凋亡，且6 h ALA孵育组细胞凋亡程度明显高于2 h组，为了探讨ALA-PDT诱导的细胞凋亡机制，我们进一步研究了细胞内ROS和MMP的变化，观察到了与凋亡率一致的细胞内ROS累积量，在各种肿瘤细胞内也发现了类似结果［13-15］。因为ROS能破坏线粒体膜完整性，导致膜上通透性转运孔开放，跨膜电位（ΔΨm）崩溃，线粒体渗透性改变，细胞色素C及其他前凋亡分子释放入胞质，激活细胞凋亡途径［16］。我们也发现，MMP的升高与ROS变化一致，提示ALA-PDT诱导的细胞凋亡与ROS产生、线粒体功能破坏有关。NAC在细胞凋亡过程中作为一种ROS清除剂［17］，可以保护线粒体免受氧化应激损害，减少细胞凋亡。我们的实验证实，加入NAC对ALA-PDT诱导的细胞凋亡有抑制作用，并显著减少了细胞内ROS产生及MMP改变，说明ALA-PDT诱导的细胞凋亡确实与ROS的氧化损伤效应有关。

综上所述，ALA-PDT可以诱导光老化人皮肤FB凋亡，且与ALA孵育时间、照光剂量呈依赖性关系，其机制与细胞氧化损伤有关，这可能是治疗皮肤光老化的基础。

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四川省医学会第十二次皮肤性病学术会议纪要

四川省医学会第十二次皮肤性病学术会议于2014年11月28-30日在成都市金河宾馆召开。来自全省200余名皮肤性病科医生参会。特邀黄俊铭、郝飞、黄柏翰、蔡昌霖、陈爱军、林昭春、兰长贵等教授做报告。冉玉平教授报告的“婴幼儿血管瘤治疗新疗法”为国际首报，让全省皮肤科医生快速感受基础和临床研究的最新进展。本次会议收到投稿150篇，有61位皮肤科医师演讲，内容涉及疑难病分享、激光、美容、色素疾病、儿童疾病、光动力、皮肤外科、感染、麻风、梅毒、护理、新疗法、皮肤镜等。成立了四川省医学会皮肤性病专委会青年委员会：主任委员冉玉平（兼），副主任委员陈涛、吕小岩、张浩，秘书何迅、钟建桥。本次会议应用新媒体、网络会议直播及微信问卷调查、微信投票等形式，首次采用E-poster展示，评出特等奖1名，一等奖3名，二等奖5名，三等奖10名并颁奖。冉玉平汇报专委会获四川省医学会目标管理工作单项类一等奖、中华医学会皮肤性病学分会“基层大讲堂”继教项目组织奖三等奖，并希望全省皮肤科医生不仅要准确诊断疾病、力争疗效好，而且应将原创性研究撰写为论文发表，将病例资源转变为学术优势，实现我省皮肤性病学跨越式发展。

Aminolevulinic acid-based photodynamic therapy induces apoptosis of prematurely senescent fibroblasts induced by ultraviolet B stress

Zhang Lichao,Zhang Hairong,Zhou Bingrong,Luo Dan,Ma Liwen,Zhang Jia′an,Wang Shen,Yi Fei,Maya Valeska Gozali,Liu Juan.Department of Dermatovenereology,First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210029,China

s:Luo Dan,Email:daniluo2013@njmu.edu.cn;Zhou Bingrong,Email:bingrong.2002@163.com

ObjectiveTo study the effect of aminolevulinic acid-based photodynamic therapy（ALA-PDT）on oxidative damage to and apoptosis of prematurely senescent fibroblasts induced by ultraviolet B stress（UVB-SIPS-FB）.MethodsBoth normal fibroblasts and UVB-SIPS-FB were divided into 2-hour and 6-hour groups with the duration of incubation with ALA away from light being 2 and 6 hours respectively,and each group was divided into 7 subgroups:control subgroup receiving no treatment,ALA subgroup treated with ALA alone,red laser group treated with 100 J/cm2red laser alone,3 ALA-PDT subgroups pretreated with ALA followed by red laser radiation at 25,50 and 100 J/cm2respectively,NAC+ALA-PDT subgroup sequentially pretreated with ALA and NAC （5 mmol/L）followed by red laser radiation at 50 J/cm2.The wavelength and power density of red laser was 635 nm and 50 mW/cm2respectively in this study.Fluorescence microscopy and flow cytometry were performed to determine the levels of reactive oxygen species（ROS） and mitochondrial membrane potentials （MMPs）,and Hoechst staining and flow cytometry to detect cell apoptosis.Statistical analysis was carried out with the software SPSS 13.0 by one-way analysis of variance（ANOVA）and qtest.ResultsThe apoptosis rate of UVB-SIPS-FB was significantly higher in the 25-,50-,100-J/cm2ALA-PDT subgroups（2-hour group:7.34%±0.87%,8.39%±1.16%and 17.03%±1.29%vs.3.81%±0.59%,F=102.70,P＜0.05;6-hour group:13.85%±1.71%,23.40%±2.14%and 41.02%±2.73%vs.5.09%±1.64%,F=106.00,P＜0.05）than in the control subgroups,but lower in the NAC+ALA-PDT subgroups（2-hour group:5.35% ±0.58%,6-hour group:9.97% ±3.23%,bothP＜0.05）than in the 50-J/cm2ALA-PDT subgroups.There was no significant difference in the apoptosis rate of UVB-SIPS-FB between the ALA subgroups or red laser subgroups and control subgroups.ALA-PDT subgroups showed significantly increased ROS level and MMP,and the degree of increase was dependent on the durationof incubation with ALA and dose of red laser,while the pretreatment with the antioxidant NAC could reduce the ALA-PDT induced increase in ROS level and MMP,which was consistent with the changes of apoptosis rate following the treatment.ConclusionALA-PDT can induce marked apoptosis of UVB-SIPS-FB,likely through the oxidative damage to cells.

Aminolevulinic acid;Ultraviolet rays;Fibroblasts;Cell aging;Photochemotherapy;Oxidative stress;Apoptosis

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.04.010

国家自然科学基金（81371757、81301384）；中国医师协会皮肤科医师分会-复旦张江光动力基金研究项目（2013）

210029南京医科大学第一附属医院皮肤性病科

骆丹，Email：daniluo2013@njmu.edu.cn；周炳荣，Email：bingrong.2002@163.com

2014-06-13）

（本文编辑：颜艳）