葡萄籽提取物对健康人体尿液的代谢组学研究

向　　欢，高　耀，彭国茳，吴丽君，田俊生，*

（1.山西大学体育学院，山西太原030006；2.山西大学中医药现代研究中心，山西太原030006）

葡萄籽提取物对健康人体尿液的代谢组学研究

向欢1，高耀2，彭国茳2，吴丽君1，田俊生2，*

（1.山西大学体育学院，山西太原030006；2.山西大学中医药现代研究中心，山西太原030006）

目的：采用1H-NMR代谢组学技术研究口服葡萄籽提取物后人体尿液中内源性代谢产物的变化规律。方法：选择16名健康男生随机平均分成两组，即试食组（A）和对照组（B）。试食组每人每天口服葡萄籽提取物软胶囊2粒，连续14d，对照组连续服用安慰剂14d。分别收集试食组及对照组服药前（0d）和服药后（14d）的晨尿，运用1H-NMR代谢组学技术分析尿液中内源性代谢产物的变化及其规律。结果：与对照组相比，服药14d后，试食组人体尿液中乳酸水平下降，肌酐水平上升，且具有显著性差异（p＜0.05，0.01）；结论：葡萄籽提取物（GSE）对人体尿液中内源性代谢产物的调节作用显著，涉及能量代谢和氨基酸代谢通路，对能量代谢的调节尤为显著，是一种很好的运动营养补充剂。1H-NMR代谢组学技术在运动科学研究中的应用前景广阔。

代谢组学，葡萄籽提取物，尿液，核磁共振，代谢产物

葡萄籽提取物（Grape Seed Extract，GSE）中的主要活性成分为原花青素，是一类具有较高生物活性的黄酮类物质［1］，分子中含有多个酚羟基，可以有效清除有害的氧自由基，是一种高效抗氧化剂，对自由基引起的过氧化损伤具有保护作用［2-3］，而导致骨骼肌损伤和疲劳的重要原因之一就是运动引起骨骼肌自由基和其他形式的活性氧增加［4］，因此，葡萄籽原花青素不仅是一种很好的运动营养补充剂，具有抗疲劳、提高运动能力的作用，而且，可以抑制红细胞膜和低密度脂蛋白过氧化，促进内皮细胞松弛因子的形成，防止血小板凝聚［5-8］。

代谢组学（Metabonomics）是研究机体代谢产物谱变化的一种系统生物学方法，可通过揭示新陈代谢动态进程中代谢产物的变化规律，全面理解机体内物质的代谢途径［9-10］。它以高通量、大规模实验方法和计算机统计分析为特征，具有“系统性”、“整体性”和“动态性”的特点［11-12］。1H-NMR、LC-MS、GCMS是代谢组学研究中常用的分析方法［13］，尤以1HNMR技术最为常用［14］。代谢组学分析的数据采集会得到多元性、复杂性的数据，需要借助专门的数据分析软件进行分析，模式识别分析如主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）以及正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）是代谢组学数据处理过程中应用最多的方法［11］。近年来，代谢组学在运动科学研究领域的应用逐年增加，代谢组学通过分析运动导致内源性物质的变化，进一步发现新的代谢通路，为运动人体科学的发展提供一个新的思路［15-16］。本文采用1H-NMR方法结合多元统计分析人体尿液中代谢产物的变化及其规律，旨在为探讨葡萄籽原花青素干预对人体代谢产物的影响机制的研究提供科学依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

千林葡萄籽提取物软胶囊（0.4g×90粒，每100mg含原花青素21.5mg）（20120810）广东保瑞药业有限公司。

Bruker 600 MHz Avance III NMR谱仪德国布鲁克公司；Centrifuge TDL-5型离心机上海安亭科学仪器厂；D2O美国默克试剂公司；其他试剂均为分析纯。

1.2实验对象

实验对象为山西大学体育学院体育教育专业大二的健康男生，共16名，随机分为试食组（A）和对照组（B），每组8人，平均年龄（19.54±0.84）岁，身高（178.29±4.35）cm，体重（69.14±6.19）kg。所有受试者均签署知情同意书并经过病史询问，排除循环、呼吸系统重大疾病史及近期内上呼吸道感染史，且近期都没有服用维生素E、维生素C等自由基清除剂以及其他中药补剂。并且实验期间，所有受试者避免海鲜、辛辣食物，饮食清淡，禁止饮酒、吸烟以减少食物对代谢造成的波动，避免剧烈的运动。

1.3实验方案及尿液样本收集

实验前（0d）清晨8∶00～9∶00空腹留取全部受试者尿液约10mL于EP管中。实验开始后，试食组每人每天口服葡萄籽提取物软胶囊2粒，连续14d，温水送服；对照组则口服外观相似的安慰剂（淀粉胶囊），连续14d。第15d清晨8∶00～9∶00再次空腹留取尿液约10mL。全部尿液样本在3000r/min离心10min，上清液于-80℃冰箱保存，待测。

1.41H-NMR代谢组学分析

1.4.1尿液样本预处理取解冻后的尿液样本500μL，置于1.5mL Eppendorf管中，加入200μL D2O配制的磷酸缓冲液（0.2mol/L Na2HPO4/0.2mol/L NaH2PO4， 81∶19，v/v，pH=7.40），并加入适量0.15%TSP（3-三甲基硅基氘代丙酸钠）作为化学位移零点的定标。4℃下13000r/min离心15min，取上清液600μL置于5mm的核磁管中待测。

1.4.21H-NMR测定条件采用NOESY脉冲序列进行样本测定，参数设置为谱宽为8kHz，混合时间为0.15s，弛豫延迟为320ms，采样点数64k，累加次数64。在弛豫延迟期间采用预饱和方式抑制水峰，谱仪偏置设置在水峰位置，自由感应衰减信号经过傅里叶变换转换为1H-NMR图谱。

1.4.31H-NMR谱图处理采用MestReNova（Mestrelab Research，Santiago de Company，Spain）核磁图谱处理软件对所有1H-NMR图谱进行相位、基线调整，并以TSP峰参考调零进行化学位移的校正。参考文献［17-18］并结合Chenomx NMR Suite数据库（加拿大Chenomx Inc.公司）软件对谱图峰进行归属。以δ 0.02为单位进行分段积分，同时排除包含水峰和尿素峰的部分（δ 4.6～6.4），即得到与化学位移值段相对应的积分值。采用归一化法，将数据归一化处理，使数据集中在0～1范围内，所得数据输出并转换为Excel文件保存，用于多元统计分析。

1.4.4多元统计学分析应用SIMCA-P 13.0（Umetric，Sweden）将积分数据中心化和规格化后，应用偏最小二乘判别分析（PLS-DA）对数据进行分析。使用SPSS 17.0（Chicago，IL，USA）软件，采用独立样本t检验，对具有差异的代谢产物进行统计分析，数据以±s表示。

2　结果与分析

2.11H-NMR图谱的指认与分析

依据每个代谢物的化学位移，裂峰情况及耦合常数，并结合Chenomx NMR Suite软件对1H-NMR谱图进行指认分析。从图谱中指认出24个代谢物，如图1所示，主要包括氨基酸、有机酸等，化学位移指认结果见表1。

图1　人体尿液样本1H-NMR谱图Fig.1　1H-NMR spectra from urine samples

2.2试食组不同时间点尿液1H-NMR谱图的PLSDA分析

试食组不同时间点尿液PLS-DA分析结果如图2所示。由图2可知，试食组2个不同时间点的尿液样本沿t［1］轴分开，表明口服葡萄籽提取物（GSE）后，人体尿液样本中的内源性代谢产物发生了变化。

表1　人体尿液样本中1H-NMR图谱中主要代谢产物峰归属Table 1　Peak attribution of main metabolites in1H-NMR spectra for urine sample

图2　试食组不同时间点尿液1H-NMR谱PLS-DA散点图Fig.2　PLS-DA scores plot in1H-NMR spectra for urine samples from GSE-treated group at different periods

2.3服药后试食组和对照组尿液1H-NMR谱图PLS-DA分析

服药后试食组和对照组尿液1H-NMR谱图PLSDA分析结果如图3所示。由图3可以看出，试食组第（14d）与对照组（0d）、试食组（0d）以及对照组（14d）分开，说明试食组（14d）尿液中代谢产物变化较为显著，即口服葡萄籽提取物（GSE）对尿液代谢产物影响较大；而对照组（14d）、对照组（0d）和试食组（0d）分开趋势不明显，表明实验14d后，对照组尿液样本内源性代谢产物变化不显著，即安慰剂对体内代谢产物影响较小。

图3　服药后试食组和对照组尿液1H-NMR谱图PLS-DA分析Fig.3　PLS-DA scores plot in1H-NMR spectra for urine samples of GSE-treated group and placebo-treated group

为了进一步探讨口服GSE后尿液中内源性代谢产物的变化及其规律，采用多元统计分析对试食组（14d）和对照组（14d）的尿液1H-NMR谱图进行单独分析，结果如图4所示。其中图4（a）为PLS-DA分析散点图，由图可知，试食组与对照组沿t［1］轴分开，表明两组尿液中的代谢产物水平存在差异。图4（b）是PLS-DA分析模型验证图，模型验证通过R2和Q2评价模型的拟合情况和预测能力，R2和Q2介于0和1之间，越接近1表示模型越有效［19-20］。图4（b）中R2（0.575）和Q2（0.831）的回归线与左边纵轴相交，且左边的R2和Q2实验值低于右边的原始值，可见上述方法模型是可靠有效的。为找出变化显著的代谢产物，得到试食组和对照组PLS-DA分析载荷图，如图4（c）所示。依据图中离原点远的点VIP值较大，变量VIP值越大，对分组的贡献就越大的原则，得到7个VIP值＞1的代谢产物（乳酸、柠檬酸、肌酐、肌酸、牛磺酸、甘氨酸、苯乙尿酸）。用SPSS软件对这些代谢产物的相对峰面积进行独立样本t检验，结果如图4（d）所示，由图可知，口服GSE 14d后，与对照组相比，乳酸和肌酐两个代谢产物的水平变化具有显著性差异（p＜0.05）。

图4　服药后试食组和对照组尿液1H-NMR谱图PLS-DA分析Fig.4　1H-NMR spectra for urine samples of GSE-treated group and placebo-treated group

3　讨论

自由基是机体正常代谢的产物，是生命活动中必不可少的能量载体。正常情况下，生物机体内自由基维持在一种平衡状态，但在出现运动疲劳、疾病等状况时，机体内自由基的产生与清除则会失去平衡。研究表明原花青素能够有效清除机体内过多的自由基［21-22］，但运用1H-NMR代谢组学技术从机体整体角度探讨原花青素对尿液代谢产物的影响及其机制研究的文献报道较少。

本文采用1H-NMR代谢组学技术对服用原花青素引起的体内代谢物的变化规律进行动态观察，探讨原花青素对人体内源性代谢物的影响机制。由1HNMR图谱及模式识别分析发现，与对照组相比，试食组中乳酸和肌酐水平显著改变。

乳酸是机体无氧代谢的产物，即机体供能过程中，糖在无氧或氧气不足情况下酵解的最终产物，在供能体系中占有重要地位。在正常的新陈代谢中，机体中基本处于酸碱平衡状态，乳酸虽然会不断被产生，但其浓度不会明显升高。当机体剧烈运动时，机体内供能加快，糖酵解供能比例增加。同时，乳酸产生速度加快，无法被及时运走而在机体内堆积，浓度增加，造成机体内pH降低，导致机体运动能力下降，产生疲劳［23］。在本实验中，与对照组相比，试食组尿液中乳酸水平明显下降，可能是葡萄籽提取物（GSE）提高了机体的有氧代谢所致。

肌酐是骨骼肌中肌酸与磷酸肌酸通过自发和不可逆的脱水缩合而形成的。一般情况下，机体内肌酐含量基本稳定，每日排出量变化很小，饮水量、饮食以及利尿剂等对肌酐的排出率没有太大的影响，被用于尿液中毒物含量检测的校正。实验中经常用肌酐量来表示被测物浓度水平与接触浓度有较好的相关性。而肌酸是由甘氨酸、甲硫氨酸以及精氨酸等3种必须氨基酸组成，前体为磷酸肌酸，是制造人体细胞能量——三磷酸腺甘（ATP）最重要的化学物质之一。机体中大约95%的肌酸储存在骨骼肌中，骨骼肌中的肌酸与高能磷酸键结合以磷酸肌酸的形式贮存自由能，以供应机体做功所需能量。正常情况下，机体内肌酸库稳定，当机体剧烈运动时，机体所需能量增加，骨骼肌中肌酸与磷酸肌酸作用加快，转化为肌酐随尿液排除体外［24-25］。本实验研究结果显示，试食组（14d）尿液中肌酐水平显著升高，说明口服葡萄籽提取物（GSE）后，机体供能加快，运动能力增强。

本实验运用1H-NMR代谢组学技术对口服葡萄籽提取物（GSE）后人体尿液中内源性代谢产物的变化及其规律进行探讨，结果表明葡萄籽提取物（GSE）对人体尿液内源性代谢物的调节作用明显，关于葡萄籽提取物的机理有待进一步深入研究。

4　结论

初步证实了葡萄籽提取物（GSE）对人体尿液中内源性代谢产物的调节作用显著，对机体代谢产物的调节涉及能量代谢和氨基酸代谢等代谢通路，对能量代谢的调节作用尤为显著，具有提高运动能力、抗疲劳的功效，是一种较好的营养补充剂，可以作为运动损伤及康复保健的理想选择。本研究为葡萄籽提取物的功效及作用机制研究提供实验依据。

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Effect of grape seed extract on endogenous metabolites in human urine

XIANG Huan1，GAO Yao2，PENG Guo-jiang2，WU Li-jun1，TIAN Jun-sheng2，*
（1.School of Physical Education，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine，Shanxi University，Taiyuan 030006，China）

Objective：To investigate the changes of endogenous metabolites in Human urine after administration of grape seed extract（GSE）via NMR-based metabolomics.Methods：Sixteen healthy male students were randomly and averagely divided into two groups（A and B）.The volunteers in the group（A）were administrated 2 GSE capsules per day for 14 days，while those in the group（B）were given the Placebo capsules only.Urine samples were collected at 0th and after administration of grape seed extract（14th）individually.The urine samples were analyzed with technique of1H-NMR and pattern recognition.Results：Compared with the Placebo-treated group，the levels of lactate decreased and the levels creatinine increased significantly in the GSE-treated group（p＜0.05，0.01）.The level of lactate，creatin，taurine in GSE-treated group were lower than the placebo-treated group with significant difference（p＜0.05）.Conclusion：As one of good nutrition supplements for sports，administration of GSE heavily regulated the endogenous metabolites，which involved with the energy metabolism and amino acid metabolism.The application of1H-NMR metabolomics technology in sports science will be in spread in the future.

metabolomics；grape seed extract（GSE）；urine；1H-NMR；metabolites

TS201.1

A

1002-0306（2015）12-0344-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.065

2014－11－18

向欢（1984-），女，硕士研究生，助教，研究方向：运动保健与中医药康复。

田俊生（1980-），男，博士，副教授，研究方向：中药药理与新药研发。

国家自然科学基金项目（81102833）。