茶多酚对高尿酸血症小鼠尿酸水平的影响及机制研究

谭明亮，陈　　刚，3，*

（1.重庆工商大学天然药物研究重点实验室，重庆400067；2.重庆工商大学催化与功能分子重庆市重点实验室，重庆400067；3.重庆工商大学环境与生物工程学院，重庆400067）

茶多酚对高尿酸血症小鼠尿酸水平的影响及机制研究

谭明亮1，2，陈刚1，2，3，*

（1.重庆工商大学天然药物研究重点实验室，重庆400067；2.重庆工商大学催化与功能分子重庆市重点实验室，重庆400067；3.重庆工商大学环境与生物工程学院，重庆400067）

为探讨茶多酚对氧嗪酸钾诱导的小鼠高尿酸血症的影响及机制，以制备氧嗪酸钾诱导的小鼠高尿酸血症模型，连续给予灌胃150、300、600mg/kg茶多酚7d，磷钨酸法检测小鼠血清尿酸含量，化学比色法检测小鼠血清及肝脏中的黄嘌呤氧化酶活性。结果表明：在茶多酚灌胃300、600mg/kg剂量下与模型组相比高尿酸血症模型小鼠血清中尿酸的含量减少22%及29%（均p＜0.01），与此同时，血清中黄嘌呤氧化酶的活性显著降低14%（p＜0.05）及21%（p＜0.01），且肝脏中黄嘌呤氧化酶的活性也显著降低16%（p＜0.05）及21%（p＜0.01）。因此茶多酚可显著降低高尿酸血症模型小鼠的血尿酸水平，且其作用机制与抑制黄嘌呤氧化酶的活性密切相关。

茶多酚，高尿酸血症，黄嘌呤氧化酶，尿酸

高尿酸血症（hyperuricemia，HUA）是由于体内嘌呤代谢异常导致血尿酸水平超出正常范围的一种机体状态。大量研究证实，HUA与动脉粥样硬化、胰岛素抵抗、高血压等疾病的发生、发展密切相关［1-2］。机体内尿酸的生成增加或排泄减少是导致高尿酸血症的重要病因，因此降低尿酸生成过程中的关键催化酶——黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）的活性或增加肾脏中尿酸的排泄成为研发抗高尿酸血症药物的主要切入点。别嘌醇作为目前我国临床使用治疗高尿酸血症的一线药物，其作用机制主要为抑制XOD的活性而减少尿酸的生成［3］。虽然别嘌醇对于高尿酸血症的疗效确切，但是其具有严重的副作用，包括发热、过敏性皮疹、白细胞及血小板减少，甚至肝功能损害［4］。因此寻找替代或增效的药物显得尤为迫切。

茶多酚（green tea polyphenols，GTP）是从茶叶中提取的一类以儿茶素为主体的酚类化合物总称。主要包括表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、没食子儿茶素没食子酸酯（gallocatechin gallate，GCG）、表儿茶素没食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）、表没食子儿茶素（epigallocatechin，EGC）、咖啡碱（caffeine，CAF）、表儿茶素（epicatechin，EC）及儿茶素（Catechin，C）［5］。已有报道发现GTP具有抗氧化、清除自由基、降低血糖、抗动脉粥样硬化、抗炎和抑菌等活性［6-7］，但GTP对HUA的影响及机制尚待明确。

本研究通过建立氧嗪酸钾（potassium oxonate，PO）诱导的小鼠HUA模型，观察GTP对小鼠HUA血尿酸水平的影响，并从调节HUA小鼠血清及肝脏中XOD活性的途径探讨其作用机制。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

SPF级昆明种小鼠雄性，体重18～22g购自重庆医科大学实验动物中心（动物合格证号：SCXK（渝）2002-0001）；市售茶叶永川秀芽（产品标准：Q/ YLC0002S，生产许可：QS508314010005）；茶多酚各成分标准品、PO均购自Sigma公司；别嘌醇购自重庆青阳药业有限公司（批号：120903，国药准字：H50021422）；乙酸乙酯、氯仿（分析纯） 均购自成都市科龙化工试剂厂；磷酸、乙腈（色谱纯） 均购自美国TEDIA公司；尿酸试剂盒、黄嘌呤氧化酶测试盒、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

Mill-iQ型纯水系统美国Millipore公司；RC24型高速冷冻离心机美国Thermo Scientific Sorvall公司；Infinite M200型酶标仪瑞士TECAN公司，SIR-50 IVC系统上海邵丰实验动物设备有限公司；Agilent 1100高效液相色谱仪美国Hewlett Packard公司；Supelco Discovery RP酰胺C16色谱柱（150mm× 4.6mm，5μm） 美国Supelco公司。

1.2实验方法

1.2.1茶多酚的制备及检测按照Wang［5］的方法，称取绿茶100g，加1L双蒸水提取3次，每次沸腾30min，将提取液收集并过滤、浓缩，浓缩液用1.5倍的氯仿萃取4次，取水相，用1.5倍的乙酸乙酯萃取水相4次，取乙酸乙酯相，旋转蒸发器蒸干得干燥样品，其提取率为15.6%（w/w）。

取1g茶叶提取物，溶于100mL沸水中，90℃孵育30min，待冷却后过滤得样品溶液，采用高效液相方法对样品溶液进行检测，使用Supelco Discovery RP

酰胺C16色谱柱（150mm×4.6mm，5μm）进行梯度洗脱：流动相A：双蒸水∶磷酸（99.95∶0.05；V/V）；流动相B：乙腈。梯度洗脱法进行洗脱如下：0～1min，2%B；2～60min，从2%B至50%B；柱温：35℃；流速0.8mL/min；在210nm处进行检测。根据相对保留时间和未知峰的紫外吸收为标准进行茶多酚成分的识别。

1.2.2模型制备小鼠HUA模型制备按照参考文献［8］方法。称取适量PO溶于生理盐水中，充分混匀后给予250mg/kg剂量灌胃，连续7d。正常组给予灌胃等量生理盐水。

1.2.3实验分组与给药60只昆明小鼠适应性喂养1周后随机分成6组，每组10只，具体如下：正常组（灌胃生理盐水）；模型组（灌胃PO造模1h后灌胃生理盐水）；阳性组［8］灌胃PO造模1h后灌胃5mg/kg别嘌醇）；GTP低剂量组（灌胃PO造模1h后灌胃150mg/kg GTP）；GTP中剂量组（灌胃PO造模1h后灌胃300mg/kg GTP）；GTP高剂量组（灌胃PO造模1h后灌胃600mg/kg GTP）。所有实验动物均在（23±2）℃下饲养，每天12h日光灯照射（7am～7pm），自由进食和饮水。以上各组连续灌胃7d。第7d给予药物灌胃1h后，处死小鼠。

1.2.4取材分析乙醚麻醉小鼠后心脏取血，于4℃下静置过夜，3000r/min离心10min，取血清保存于-70℃待用。小鼠肝脏，于冰上按1∶9的重量加入生理盐水充分研磨，4℃下12000r/min离心15min，取上清液保存于-70℃下待用。用前4℃解冻，按照相关试剂盒说明书检测出血清尿酸含量和血清、肝脏单位蛋白质条件下的XOD活性［9］。

2　结果与分析

2.1茶多酚高效液相检测

通过对GTP进行高效液相检测得出茶多酚的图谱及茶多酚中不同组分的含量，分别见图1及表1。

图1　茶多酚高效液相检测图谱Fig.1　The chromatogram of GTP using a HPLC system

2.2GTP对血清尿酸含量的影响

由图2可知，给予小鼠灌胃PO后，发现模型组小鼠血清尿酸含量与正常组相比显著增高68%（p＜0.01）。给予阳性药别嘌醇后，小鼠血清尿酸含量与模型组相比显著减少45%（p＜0.01），这些变化程度与Chen［8］的研究中的结果相近。同样，给予GTP灌胃300、600mg/kg剂量后，血清尿酸含量与模型组相比分别显著减少22%和29%（p＜0.01）。但是在给予150mg/kg剂量灌胃时，血清尿酸含量与模型组没有显著性差异，但是具有降低的趋势。

表1　茶多酚成分含量Table 1　Components content of GTP

图2　GTP对HUA小鼠血清尿酸含量的影响Fig.2　Effect of GTP on serum uric acid content in HUA mice

2.3GTP对血清中XOD活性的影响

由图3可知，给予小鼠灌胃PO后，模型组小鼠血清中XOD的活性与正常组相比显著增高41%（p＜0.01）。给予别嘌醇后，小鼠血清中XOD活性与模型组相比显著降低32%（p＜0.01），减少程度与之前Yan［9］的研究结果相近。给予GTP灌胃300、600mg/kg剂量后，小鼠血清中XOD活性与模型组相比分别显著降低14%和21%（p＜0.05和p＜0.01）。在给予150mg/kg剂量灌胃时，血清中XOD活性与模型组没有显著性差异，但是具有降低的趋势。

2.4GTP对肝脏中XOD活性的影响

由图4可知，给予PO造模后，模型组小鼠肝脏中XOD活性与正常组相比显著增高32%（p＜0.01）。给予阳性药物别嘌醇后，小鼠肝脏中XOD活性与模型组相比显著降低46%（p＜0.01）。给予GTP灌胃300、600mg/kg剂量后，小鼠肝脏中XOD活性与模型组相比分别显著降低16%和21%（p＜0.05和p＜0.01）。在给予150mg/kg剂量灌胃时，肝脏中XOD活性与模型组没有显著性差异，但是具有降低的趋势。

图3　GTP对HUA小鼠血清中XOD活性的影响Fig.3　Effect of GTP on serum XOD activity in HUA mice

图4　GTP对HUA小鼠肝脏中XOD活性的影响Fig.4　Effect of GTP on the liver XOD activity in HUA mice

3　讨论

高尿酸血症的定义为血清中尿酸含量男性≥7mg/dL，女性≥6mg/dL［10］。且体内约占含量的80%尿酸来源于内源性产生，包括体内氨基酸、核酸的代谢［11］。其中，嘌呤代谢过程中相关酶活性的增强是尿酸生成过多的主要原因，例如XOD能够催化黄嘌呤代谢为次黄嘌呤并进一步生成尿酸，XOD活性的增加是导致尿酸生成的主要因素。在啮齿类动物体内，嘌呤代谢生成的尿酸能够通过尿激酶（uricase）的催化生成尿囊素（allantoin），以便于排出体外，但是该酶基因在人类及灵长类动物进化过程中丢失［12］。在本实验中，采用氧嗪酸钾抑制尿激酶的活性，来达到与人类相似的高尿酸血症模型。在实验结果中，模型组血清尿酸含量较正常组相比显著升高（p＜0.01），在给予当前高尿酸血症治疗药物别嘌醇后，阳性组与模型组相比尿酸含量显著减少（p＜0.01）。说明使用该模型代表人类高尿酸血症来进行研究是合理的。

茶在我国饮用历史悠久已被视作世界三大饮料之一［13］，在其走向全球化的同时，各国研究人员也在对其生物活性功能不断进行研究开发。包括抗氧化及清除体内自由基［14］、抑菌［15］、抗病毒［16］、改善心血管类疾病［17］、抗癌抗肿瘤［18］等活性，但是茶多酚对于高尿酸血症的影响及相关机制尚待明确。在本实验中，发现茶多酚在300、600mg/kg剂量时，能够明显减少小鼠血清中的尿酸含量（p＜0.01）。且在相关研究中已经证实茶多酚对小鼠LD50为（2496±326）mg/kg［19］。在本实验中采用的剂量明显低于该剂量，说明茶多酚在其安全剂量下对于高尿酸血症小鼠具有明显改善作用。

XOD广泛存在于各种动物及人体内，从其在器官上的分布来看，主要分布于肝脏及小肠中［20］。但是高尿酸血症患者体内由于肝脏代谢活动增强，导致肝细胞细胞膜的通透性增加，使得血清中XOD的含量与体内XOD的含量呈现一定的数量关系［20］。但是由于细胞膜的选择性通过，使得部分物质对于血清及肝脏中XOD的影响不尽相同［21］，因此将肝脏及血清中的XOD的活性作为检测指标来体现小鼠体内XOD的活性。在本实验中，模型组的血清及肝脏中XOD的活性较正常组相比具有显著性增加（p＜0.01）。在给予灌胃300、600mg/kg剂量茶多酚时，血清及肝脏中的XOD的活性均具有显著性降低（p＜0.05或p＜0.01）。在GTP灌胃150mg/kg剂量组中，其XOD活性与模型组相比没有显著性降低，但是具有降低的趋势，可能与其给予的剂量还不足于明显影响肝脏中XOD的表达，且随剂量的增加，其抑制效果越明显。说明茶多酚具有降低小鼠血清及肝脏中XOD活性的作用，且具有剂量依赖性。

在实验中发现，给予茶多酚600mg/kg剂量，其抑制体内XOD活性及降低血清尿酸含量的的作用较模型组相比均具有较大的作用（p＜0.01）。由于别嘌醇在其口服剂量范围内具有显著的毒副反应，从而限制了其在临床的的应用［22］，因此接下来的工作是通过研究给予别嘌醇治疗的同时如何应用茶多酚作为补充药物，以便于在保证效果的同时降低别嘌醇在临床上的剂量，来降低其毒副作用。

4　结论

本研究证实，GTP能减少高尿酸血症模型小鼠血清尿酸水平，其作用机制与抑制小鼠肝脏及血清中XOD活性密切相关。虽然其效果不及临床用药——别嘌醇明显，但是通过本研究，为将GTP开发为新的降尿酸药物或辅助药物提供了实验依据。

［1］臧路平，刘志刚，吴新荣.高尿酸血症发病机制及其药物治疗研究进展［J］.医药导报，2011，30（1）：69-73.

［2］李东晓，迟家敏.高尿酸血症与代谢综合征［J］.国外医学·内分泌学分册，2004（6）：386-388.

［3］牛艳芬，朱华结，马加，等.黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选及P40的降尿酸作用研究［J］.中药药理与临床，2011，27（11）：18-20.

［4］王春辉，李松.黄嘌呤氧化酶抑制剂的研究进展［J］.国外医学药学分册，2006，33（5）：351-353，357.

［5］Wang YY，Yang XR，Li KK，et al.Simultaneous determination of theanine，gallic acid，purine alkaloids，catechins，and theaflavins in black tea using HPLC［J］.International Journal of Food Science and Technology，2010（45）：1263-1269.

［6］朱桂勤，李建科.茶多酚的功能研究进展［J］.食品研究与开发，2005，26（1）：33-35.

［7］倪静，孙慧.茶多酚的研究进展［J］.中国药物经济学，2013（S3）：40-41.

［8］Chen YS，Hu QH，Zhang X，et al.Beneficial effect of rutin on oxonate-induced hyperuricemia and renal dysfunction in mice［J］. Pharmacology，2013（92）：75-83.

［9］Yan HY，Ma Y，Liu M，et al.The dual actions of Paederia scandens extract as a hypouricemic agent：xanthine oxidase inhibitory activity and uricosuric effect［J］.Planta Med，2008（74）：1345-1350.

［10］叶瑛，贾楠.高尿酸血症-心血管事件的独立危险因素［J］.国际心血管病杂志，2010，37（4）：229-231.

［11］刘佳，李玲.高尿酸血症的发病机制与药物治疗研究进展［J］.国际药学研究杂志，2010，37（1）：24-28

［12］赵莹，张启虹，冯明声，等.降尿酸药物黄嘌呤氧化酶抑制剂的研究进展［J］.药学进展，2009，33（2）：55-61.

［13］Macedo JA，Battestin V，Riberiro ML，et al.Increasing the antioxidantpowerofteaextractsbybiotransformationof polyphenols［J］.Food Chemistry，2011（126）：491-497.

［14］全吉淑，尹学哲，金泽武，道.茶多酚自由基清除及抗脂蛋白氧化作用研究［J］.中药药理与临床，2007，23（3）：75-77.

［15］王莹.茶多酚的抗氧化和抑菌活性及其增效剂［J］.生物学杂志，2007，24（5）：54-56.

［16］Peng HQ，Cai WM，Xiang X，et al.The anti-influenzavirus A3 action in vitro of tea polyphenols［J］.J Tea Sci，2003，23（1）：79-81.

［17］Nagao T，Hase T，Tokimitsu I.A green tea extract high in catechins reduces body fat and cardiovascular risks in humans［J］.Obesity（Silver Spring），2007，15（6）：1473-1483.

［18］McLarty J，Bigelow RL，Smith M，et al.Tea polyphenols decrease serum levels of prostate-specific antigen，hepatocyte growth factor，and vascular endothelial growth factor in prostate cancer patients and inhibit production of hepatocyte growth factor and vascular endothelial growth factor in vitro［J］.Cancer Prev Res（Phila Pa），2009，2（7）：673-682.

［19］杨贤强，贾之慎，沈生荣，等.茶多酚类毒理学实验及其评价［J］.浙江农业大学学报，1992，18（1）：23-29.

［20］孔悦，张冰，刘小青，等.黄嘌呤氧化酶活性在高尿酸血症动物模型中的变化［J］.北京中医药大学学报，2004，27（6）：38-41.

［21］Hou CW，Lee YC，Hung HF，et al.Longan seed extract reduces hyperuricemia via modulating urate transporters and suppressing xanthine oxidase activity［J］.Am J Chin Med，2012，40（5）：979-991.

［22］蔡泳，陈雪观.别嘌醇致严重不良反应分析［J］.医药导报，2012，31（2）：264-266.

Study on effect and mechanism of tea polyphenols on serum uric acid in hyperuricemic mice

TAN Ming-liang1，2，CHEN Gang1，2，3，*
（1.Chongqing Key Laboratory of Nature Medicine Research，Chongqing Technology and Business University，Chongqing 400067，China. 2.Chongqing Key Laboratory of Catalysis and Functional Organic Molecules，Chongqing Technology and Business University，Chongqing 400067，China. 3.School of Environmental and Biological Engineering，Chongqing Technology and Business University，Chongqing 400067，China）

To explore the effect of tea polyphenols on hyperuricemia（HUA）in mice and its potential mechanism，HUA was induced by intragastric administration of potassium oxonate in mice.HUA mice were treated with 150，300 and 600mg/kg tea polyphenols for 7 days.Uric acid level in serum was tested by phosphotungstic acid assay.Xanthine oxidase activity in serum and liver was determined by chemical colorimetric assay. Results showed that after treatment with 300 and 600mg/kg tea polyphenols，serum level of uric acid markedly reduced by approximate 22%and 29%（both p＜0.01）compared with that of model group.Meanwhile，xanthine oxidase activity in serum markedly decreased by approximate 14%（p＜0.05）and 21%（p＜0.01），as well as the liver xanthine oxidase activity markedly decreased 16%（p＜0.05）and 21%（p＜0.01）.In conclusion，tea polyphenols might reduce the level of uric acid in hyperuricemic mice，and the hypouricemic effect of tea polyphenols might be closely associated with the inhibition of xanthine oxidase activity.

tea polyphenols；hyperuricemia；xanthine oxidase；uric acid

TS201.4

A

1002-0306（2015）12-0349-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.066

2014－09－27

谭明亮（1990-）男，硕士研究生，研究方向：生物质资源化利用。

陈刚（1974-）男，博士，副研究员，研究方向：天然产物抗炎免疫调节作用与机制研究。

重庆工商大学科学研究项目（1352010）。