锐孔凝固浴法制备表面活性肽微胶囊

张生生，闫静芳，陆兆新，张丽娟，武奔月，陈阳阳，王昱沣

（南京农业大学食品科技学院，江苏南京210095）

锐孔凝固浴法制备表面活性肽微胶囊

张生生，闫静芳，陆兆新，张丽娟，武奔月，陈阳阳，王昱沣*

（南京农业大学食品科技学院，江苏南京210095）

采用锐孔凝固浴法制备表面活性肽微胶囊，并以海藻酸钠为壁材，氯化钙溶液作为固化液。在单因素的基础上，以包埋率作为评价指标，通过响应面实验对微胶囊制备过程中的氯化钙浓度、芯壁比、海藻酸钠浓度、操作温度四个因素进行优化。结果表明：氯化钙浓度为2%，操作温度为49℃，海藻酸钠与表面活性肽比例为1∶2，海藻酸钠浓度为2.4%时，包埋率达到了87.6%，载药量为12.5%。通过肠液缓释实验发现，微胶囊在9h内的释放率达到了91.7%，具有很好的缓释效果。

锐孔凝固浴法，微胶囊，表面活性肽，响应曲面法

抗菌脂肽是由β-胺基脂肪酸与多肽以酰胺键结合而成［1］，并同时具有亲水和亲油基团的两亲型物质［2］。主要包括Surfactin（表面活性肽）、Iturin（伊枯草菌素）、Fengycin（芬荠素）等［3］，它们的合成是在革兰氏芽孢杆菌内以非核糖体的方式进行［4-7］。Surfactin的分子则是由一个C（13～15）的脂肪酸链与一个由七个氨基酸构成的多肽环以酰胺键的形式结合而成，分子量约为1000。

Surfactin是具有很高表面活性的生物类表面活性剂，相较于现在大量使用的化学合成表面活性剂，具有易降解、环保的优点，是表面活性剂未来的发展趋势［8］。Surfactin的两亲分子结构能够提高微生物对石油类物质的利用，促进原油的分解，对那些被原油污染地区的土壤生态回复过程起到非常明显的作用［9-10］，能够有效缓解石油污染对环境的危害。研究还发现，Surfactin能够有效地抑制真菌和细菌、病毒等病原体的生长［11］，同时具有高效、不易产生抗药性，因此可作为代替传统抗生素的新型抑菌剂在医药行业中使用。Surfactin作为一种生物活性物质，虽然具有潜在的应用前景，但是相较于化学合成类物质具有十分不稳定的分子结构。暴露于过热、过酸碱等逆境中，易受到外界环境的影响，甚至被一些微生物降解。因此为扩大Surfactin的应用范围，使其持续有效地发挥生物活性，有必要采取措施增强Surfactin抵御外界不利环境的能力。微胶囊技术是未来食品与医药行业重点研究的领域，它不但能够保护生物分子的活性，还能使其获得缓释的能力。而锐孔法微胶囊技术所需要的设备简单，生产成本低，易于工业上的扩大生产。将锐孔凝固浴法应用于surfactin的包埋能够提高其在环境中的稳定性，并获得缓释的能力，为工业化生产提供参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

淀粉液化芽孢杆菌fmb50为南京农业大学酶工程实验室构建与保藏；海藻酸钠国药集团化学试剂有限公司；无水氯化钙上海久亿化学试剂有限公司；乙醇南京试剂厂；乙腈、三氟乙酸（色谱纯） 德国Merck公司；超纯水娃哈哈集团公司。

ZQTY-70振荡培养箱上海知楚仪器有限公司；HH-2数显恒温水浴锅上海维城仪器有限公司；GZX-9240MBE电热鼓风干燥箱上海博迅实业有限公司仪器设备厂；5mL注射器常州市回春医疗器材有限公司；WH-1微型旋涡混合仪上海沪西分析仪器厂有限公司；CP-114先行者精密电子天平美国OHAUS公司；SB5200DT超声波清洗器宁波新芝生物科技股份有限公司；Agilent 1100高效液相色谱仪美国Aglient公司。

1.2实验方法

1.2.1抗菌脂肽样品的制备采用摇瓶发酵的方法制备样品，在landy培养基的基础上添加3‰的大豆油，接种后在33℃，180r/min条件下振荡培养36h，经分离纯化得到抗菌脂肽样品［12］。

1.2.2微胶囊制备流程将制备的抗菌脂肽样品溶于超纯水后，混匀，再加入一定比例的海藻酸钠，水浴40℃溶解，将装有混合液的25mL烧杯放置在所设定的温度水浴锅中，使用5mL的注射器吸取适量的混合液，以较快的速度推动活塞，但是维持注射器前端滴下的液滴呈明显的颗粒。造粒结束后固化0.5h，固化液为氯化钙溶液，然后进行抽滤，得到抗菌脂肽湿微囊。在45℃烘箱中烘干得到抗菌脂肽微胶囊成品［13］。

抗菌脂肽样品+超纯水→涡旋混合→加入海藻酸钠→混合→水浴，溶解→锐孔造粒→凝固浴凝固→抽滤，干燥→成品

1.2.3单因素实验

1.2.3.1氯化钙对包埋率的影响称取一定量的抗菌脂肽样品以1∶1的比例与海藻酸钠混合，溶解后使海藻酸钠浓度为2%，置于40℃水浴锅中，造粒时固化液氯化钙的浓度设置为1%、2%、3%、4%，固化0.5h，抽滤干燥后，洗脱微囊表面的抗菌脂肽，并以HPLC法测定其含量，计算包埋率。

1.2.3.2操作温度对包埋率的影响称取一定量的抗菌脂肽样品以1∶1的比例与海藻酸钠混合，溶解后使海藻酸钠浓度为2%，置于20、30、40、50℃水浴锅中，造粒时固化液氯化钙的浓度为2%，固化0.5h，抽滤干燥后，洗脱微囊表面的抗菌脂肽，并以HPLC法测定其含量，计算包埋率。

1.2.3.3芯壁比对包埋率的影响称取一定量的抗菌脂肽样品以3∶1、2∶1、1∶1、1∶2的比例与海藻酸钠混合，溶解后使海藻酸钠浓度为2%，置于40℃水浴锅中，造粒时固化液氯化钙的浓度设置为2%，固化0.5h，抽滤干燥后，洗脱微囊表面的抗菌脂肽，并以HPLC法测定其含量，计算包埋率。

1.2.3.4海藻酸钠浓度对包埋率的影响称取一定量的抗菌脂肽样品以1∶1的比例与海藻酸钠混合，溶解后使海藻酸钠浓度为1.0%、1.5%、2%、2.5%，置于40℃水浴锅中，造粒时固化液氯化钙的浓度设置为2%，固化0.5h，抽滤干燥后，洗脱微囊表面的抗菌脂肽，并以HPLC法测定其含量，计算包埋率。

1.2.4微胶囊制备工艺的响应曲面法优化根据Box-Benhnken的中心组合实验设计原理，综合单因素实验结果，以微胶囊的包埋率为响应值（Y），每一个自变量的低、中、高实验水平分别以-1、0、+1进行编码。因素编码及水平见表1。每组实验重复3次。

表1　响应曲面法实验水平及编码Table 1　Levels and codes of response surface experiments

1.2.5包埋效果的评定采用包埋率作为微胶囊包埋效果的评价指标，制备的微胶囊加入到5mL乙醇中，25℃，200r/min条件下恒温振荡洗脱0.5h。然后通过HPLC检测洗脱液中的Surfactin含量c（mg/mL）。

包埋率的计算：

包埋率（%）=（m-5c）/m×100

式中，m：加入样品的总质量，mg。

1.2.6缓释性能的研究将以100mg样品制备的微胶囊置于100mL人工胃液、肠液［14］中，37℃，200r/min条件下振荡，分别在0.5、1、……、30h时量取缓释液，并通过液相检测其中的Surfactin的含量，计算释放率。

1.2.7载药量的计算载药量为微囊内抗菌肽的质量与微囊总质量之间的比值。取一定量的样品，制备微胶囊后，完全烘干，称量微胶囊的质量m1（mg）。然后在研钵中将微胶囊研碎，加入10mL的无水乙醇，充分混合溶解后，离心得到上清液。以液相检测上清液中的抗菌脂肽含量c（mg/mL）

载药量（%）=10c/m1×100

式中，c上清液中抗菌脂肽的含量，mg/mL；m1为制备得到的微胶囊总质量，mg。

1.3数据处理

本文实验均为三次重复实验，采用SAS 8.0和Design Expert 8.0进行数据统计分析，显著水平为p＜0.05，作图为Orgin 8.0版本。

2　结果与讨论

2.1单因素实验

2.1.1氯化钙浓度对包埋率的影响如图1所示，在氯化钙浓度小于2%的范围内包埋率呈上升的趋势，这是因为随着氯化钙浓度的升高，海藻酸钠与Ca+在微囊表面形成致密的保护层，能够有效的将Surfactin包封在微囊的内部。但是当氯化钙浓度高于2%时，包埋率反而呈现下降的趋势。因为当氯化钙浓度过高时，微囊表面形成的保护层过于致密，当以45℃进行烘干时，烘干时间增加，并且微囊表面部分破裂，导致已经包埋的样品被洗脱下来，包埋率因此下降。经过显著性分析，发现当氯化钙浓度为2%时，与其他因素之间差异性显著。因此选取2%的氯化钙浓度最为该组实验的最佳条件。

图1　氯化钙浓度对包埋率的影响Fig.1　Effect of concentration of calcium chloride on the encapsulation efficiency

2.1.2温度对包埋率的影响由图2可知，在50℃范围内，随着温度的升高，Surfactin包埋率一直在上升。这是因为较高温度条件能够促进海藻酸钠分子结构的展开，在一定范围内，随着温度的升高，海藻酸钠与钙离子的聚合反应也会加烈，在微囊表面形成致密的保护层。但是考虑到Surfactin与海藻酸钠都是生物活性物质，超过一定温度会使分子结构发生变化，失去生物活性。经过显著性分析发现50℃时与其他因素之间差异性显著，因此综合考虑选取50℃作为温度单因素实验的最佳条件。

图2　温度对包埋率的影响Fig.2　Effect of temperature on the encapsulation efficiency

2.1.3芯壁材比对包埋率的影响由图3可知，当海藻酸钠与Surfactin比例由2∶1～1∶2时，包埋率变化范围不大，差异不显著。海藻酸钠与Surfactin比例增加到1∶3时，包埋率急剧下降，形成微囊的形状不规则。而且随着抗菌脂肽所占比例的提高，微胶囊载药量随之增加。当以包埋率为指标时，经过显著性分析，海藻酸钠与Surfactin比例为1∶3与其他实验点之间的差异性显著，下降趋势明显。当以载药量为指标时，海藻酸钠与Surfactin比例（2∶1，1∶1）同（1∶2，1∶3）之间的差异性显著（p＜0.05）。但是海藻酸钠与Surfactin比例1∶2同海藻酸钠与Surfactin比例1∶3之间的差异性不显著，载药量的上升趋势不明显。综合考虑包埋率和载药量两个指标，选取1∶2作为最佳的海藻酸钠：Surfactin比例。

图3　芯壁比对包埋率的影响Fig.3　Effect of the rate（surfactin∶sodium alginate）on encapsulation efficiency

2.1.4海藻酸钠浓度对包埋率的影响由图4可知，随着海藻酸钠浓度的升高，包埋率先升高后下降。是因为在海藻酸钠浓度超过2.5%时，微囊固化效果虽然更好，但是混合液的粘度很大，而造粒时使用的注射器孔径较小，造成造粒压力极大。而且微囊在氯化钙溶液中呈现不成形的片状，包埋效果变差。浓度为2.0%时，与其他水平之间差异性显著。因此选取2.0%作为制备过程中最佳的海藻酸钠浓度。

图4　海藻酸钠浓度对包埋率的影响Fig.4　Effect of concentration of calcium chloride on the encapsulation efficiency

2.2响应曲面法优化微胶囊制备工艺条件

2.2.1响应曲面法实验实验结果见表2。

2.2.2回归模型的建立及显著性分析利用Design expert 8.0进行多元回归拟合，得到以包埋率为响应值（Y）对氯化钙浓度（A）、温度（B）、芯壁比（C）、海藻酸钠浓度（D）四个因素的二次多项回归方程为：Y= 0.86-0.046A-0.027B-0.004933C-0.10D+0.023AB+ 0.02AC+0.016AD-0.12BC+0.034BD+0.065CD-0.19A2-0.11B2-0.22C2-0.19D2

回归方程方差分析结果如表3所示：

模型的回归分析见表3。该模型的p＜0.01，说明模型是极显著的，与实验的拟合度高，能够很好地反应各因素与响应值之间的真实关系。失拟项值＞0.05，该项不显著，说明实验中的误差控制在合理的范围内，模型能够充分反映实际情况。通过对每个因素方差分析的比较可以发现，氯化钙浓度、海藻酸钠浓度、操作温度的一次项及其二次项，芯壁比的二次项，海藻酸钠浓度与芯壁比、海藻酸钠与操作温度、芯壁比与操作温度的交互影响的p＜0.01，说明对包埋率的影响极其显著。而芯壁比的一次项，氯化钙浓度与海藻酸钠浓度、芯壁比、操作温度交互作用的p＞0.05，说明对包埋率的影响不显著。

表2　Box-Behnken设计方案及包埋率的测定值Table 2　Box-Behnken design matrix and the response of the dependent variables of encapsulation efficiency

表3　方差分析结果Table 3　Results of variance analysis

图5　温度与芯壁比（海藻酸钠∶srf）对包埋率影响的响应面图Fig.5　Response surface for effect of temperature and ratio of wall to core on the capsulation efficiency

2.2.3响应面分析从方差分析中可知，氯化钙浓度与另外三个因素之间的交互关系不显著，即氯化钙浓度对包埋率的影响是简单的线性关系。为了考察微胶囊制备工艺其他三个因素中两个因素之间的交互影响，将其他因素保持不变，就可以得到反映该两种因素对包埋率影响的响应曲面图和等高线图，见图5～图7。温度与芯壁比、芯壁比与海藻酸钠浓度的交互作用极显著，温度与海藻酸钠浓度的交互作用显著，与方差分析中的p值分析结果一致。

2.2.4包埋工艺的优化组合及其验证根据BBD实验结果和二元多次回归方程，利用Design Expert软件计算出最佳的微胶囊制备工艺，为了实际中较易操作，对结果进行了调整：氯化钙浓度为2%，操作温度为49℃，海藻酸钠与Surfactin比例为1∶2，海藻酸钠浓度为2.4%时，包埋率高达88.5%。根据得到的工艺条件进行验证实验，实验所测其包埋率为87.6%，与理论值相比下降了1.01%。由此可见，本实验建立的模型很好的预测了实验结果。

2.3微胶囊缓释性能的研究

经过检测发现在模拟胃液中未发现Surfactin，这是因为海藻酸钠与钙离子形成的聚合物在胃液的酸性pH（1.5～2.0）条件下稳定，微囊表面不发生破裂，所以没有样品释放。肠液的pH为6.8，在此条件下，海藻酸凝胶发生肿胀，导致表面破裂，随着时间的延长，内部的样品逐渐被释放出来。释放效果如图8所示，在时间为9h时，微胶囊的累计释放率已经达到91.7%。实验结果表明微胶囊在进入生物体后，在胃液中稳定，进入肠液中会缓慢释放出来，被生物体吸收。微胶囊能够作为动物类抗生素药物使用。

图6　温度与海藻酸浓度对包埋率影响的响应面图Fig.6　Response surface effect of temperature and concentration of sodium alginate on the capsulation efficiency

图7　海藻酸钠浓度与芯壁比（海藻酸钠∶srf）对包埋率影响的响应面图Fig.7　Response surface for effect of concentration of sodium alginate and proporation of wall to core on the capsulation efficiency

图8　微胶囊在模拟肠液中的累计释放Fig.8　The cumulative release of microcapsule in simulation of intestinal juice

3　结论

通过单因素实验确定在Surfactin微胶囊制备过程中各项工艺的最佳值，然后通过BBD中心组合设计与响应面分析，建立包埋率与影响因素的二次多项数学模型，经过实验验证模型显著，具有很好的拟合度，能够预测出最佳的包埋工艺。优化的最佳条件为：氯化钙浓度为2%，操作温度为49℃，海藻酸钠与Surfactin比例为1∶2，海藻酸钠浓度为2.4%时，包埋率达到了87.6%。本实验采用的包埋方法，操作简单，而且包埋效果良好。经过计算发现微胶囊的载药量达到12.5%。Surfactin的微胶囊化能够提高在环境中的稳定性，获得缓释的性能，在人工肠液中的累计释放率达到91.7%，为抗菌脂肽微胶囊能够作为口服抗生素使用提供了初步实验基础。但是现阶段锐孔凝固浴存在规模放大困难、微囊粒径大的问题，相信未来通过改变造粒方式，例如通过氮气压力推动造粒能够提高造粒效率、减小粒径。

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The preparation of surfactin microcapsules by the method of piercing-solidifying

ZHANG Sheng-sheng，YAN Jing-fang，LU Zhao-xin，ZHANG Li-juan，WU Ben-yue，CHEN Yang-yang，WANG Yu-feng*
（College of Food Science and Technology，Nanjing Agriculture University，Nanjing 210095，China）

In this paper，piercing-solidifying method was applied to obtain the capsules of surfactin with sodium alginate as wall material and calcium chloride as solid solvent.On the basement of one-factor experiments，four factors including calcium chloride and sodium alginate concentration，ratio of core to wall，temperature were optimized by the method of response surface.The performance of all factors was evaluated by the microencapsulation efficiency.The results showed，under the condition of calcium chloride concentration 2%，temperature 49℃，the proportion of sodium alginate to surfactin 1∶2，sodium alginate concentration 2.4%，the microencapsulation efficiency reaches 87.6%，the load ratio of drug reaches 12.5%.The release rate of Surfactin from the microcapsule reached 91.7%，which showed that it had good slow-release effect.

piercing-solidifying method；microcapsules；surfactin；response surface method

TS201.2

B

1002-0306（2015）12-0221-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.038

2014－09－24

张生生（1989-），男，在读硕士研究生，主要从事食品科学和生物发酵方面的研究。

王昱沣（1976-），男，副教授，主要从事生物分离方面的研究。

中央高校基本业务专项基金（KYZ201154）；江苏高校优势学科建设工程资助项目和江苏省优势学科人才引进项目（80900210521）。