柿单宁凝胶固定啤酒酵母菌发酵工艺研究

孙肖园，张宝善，*，刘莎莎，罗　　腾，黄　　雯

（1.陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安710119；2.陕西省果蔬深加工技术研究中心，陕西西安710119；3.西北政法大学商学院，陕西西安710119）

柿单宁凝胶固定啤酒酵母菌发酵工艺研究

孙肖园1，2，张宝善1，2，*，刘莎莎1，罗腾1，黄雯3

（1.陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安710119；2.陕西省果蔬深加工技术研究中心，陕西西安710119；3.西北政法大学商学院，陕西西安710119）

目的：比较游离酵母菌、柿单宁凝胶固定的酵母菌和常用的海藻酸钠PVA复合材料固定的酵母菌对发酵速度的影响，并探究柿单宁凝胶包埋的啤酒酵母菌对麦芽汁的最佳发酵条件。方法：从青牛心柿果中提取的柿单宁与交联剂混合，包埋啤酒酵母菌，用柿单宁凝胶固定啤酒酵母菌对麦芽汁进行发酵，在单因素实验的基础之上，通过正交实验研究发酵温度、包埋量、pH和初始糖度对固定化酵母菌发酵的影响。结果：柿单宁凝胶固定的啤酒酵母菌与其他材料包埋的酵母菌相比，真实发酵度最高，达96.05%；最佳发酵条件为：包埋量10（包埋剂和酵母菌的体积比），麦芽汁初始糖度14%，pH为4.0，发酵温度30℃，此条件下，真实发酵度可达97.2%。结论：制备柿单宁凝胶条件温和，增大了包埋后酵母菌的活性，而且为这种材料的广泛使用提供了可能。

柿单宁，凝胶，固定化酵母菌，发酵

啤酒酵母菌是酿造葡萄酒、啤酒和其他果酒最主要的酒精发酵菌种。包埋酵母菌常用的海藻酸钠在含高浓度的磷酸盐或在含有Mg2+、K+等阳离子溶液中形成的凝胶不稳定、易破碎和溶解［1］；有机合成的高分子凝胶强度好，但大部分有毒性，另外它们形成的凝胶传质性能较差，在对细胞进行包埋的过程中因自身的毒性和凝胶交联过程中会放热降低酵母菌的活性。因此，研究和开发新的酵母菌固定材料和固定技术是十分必要的。

中国是涩柿的原产国，也是主产国，有丰富的柿资源。2013年我国的涩柿产量达460万吨。其中产生落果、次果近100万吨，这些果实得到不合理利用而造成资源的大量浪费。柿果含有丰富的单宁物质，青柿果含单宁2%以上。单宁是一种天然高分子酚类化合物，自身可进行酚羟基的缩合反应，产生凝胶，我国常用作木材胶黏剂、金属络合剂的栲胶、烤漆就是利用这一原理，从富含单宁的植物材料中提取单宁，再经过缩合而形成胶团。另外，柿单宁的大量酚羟基与蛋白质主链的氨基、羧基之间通过疏水和氢键作用也可发生交联反应，产生凝胶［2-3］。Inoue K等学者分别从柿果肉和柿皮中提取柿单宁，并与甲醛等聚合剂反应制成凝胶，吸附废水中的重金属离子如Cr2+、Hg2+、Ni2+等，取得一定的研究成果［4-6］。廖学品等学者利用黑荆树单宁与动物胶原蛋白作用制备凝胶吸附剂［7］。

本实验以涩柿果为原料提取柿单宁，根据单宁自身的缩合性及和蛋白质之间的胶凝作用，与明胶蛋白反应，包埋啤酒酵母菌［8］。此方法与传统方法相比较，安全、无毒，包埋率高，而且能最大程度的保持及提高酵母菌的发酵活力。本研究为柿单宁凝胶的制备、固定化啤酒酵母菌以及发酵工艺提供了新的技术参数，也为解决大量的涩柿落果、次果，提高其经济价值有很好的意义。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

涩柿牛心柿，采摘于西安市长安区大居安村，平均单果重25～35g；发酵菌株啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae），保存于食品发酵实验室；香草醛、儿茶素、无水甲醇、无水乙醇、丙酮、浓硫酸、明胶、聚乙烯二醇（PVA）、海藻酸钠等其他试剂均为分析纯，西安晶博生物科技有限公司。

S.SW-CJ-1F型净化工作台上海跃进医疗器械厂；Motic（BA200）光学显微镜厦门麦克奥迪实业集团有限公司；隔水式（GSP-9080MBE）电热恒温培养箱上海博迅实业有限公司医疗设备厂；LXJ-Ⅱ离心沉淀机上海医用分析仪器厂；高压灭菌器上海佳腾实验设备有限公司；UNICO2000型可见分光光度计上海尤尼柯仪器有限公司；电子恒温电热套北京化玻联医疗器械有限公司；PHs-3c型精密pH计上海精密科学仪器有限公司；JSM-6700F型扫描电镜日本电子有限公司。

1.2实验方法

1.2.1菌悬液的制备取保藏的啤酒酵母菌种于盛有200mL无菌水的三角瓶中活化24h，并用划线法将其接种于斜面培养基于30℃培养箱扩大培养20h后，将其接种于250mL的液体培养基培养10h。将该啤酒酵母菌培养液在无菌条件下3000r/min离心10min，倾去上清液。用无菌生理盐水洗涤菌体，再离心后得湿菌体。加入无菌水制成菌液浓度为2.8×109cfu/mL菌悬液备用。

1.2.2发酵用麦芽汁的制备方法将干麦芽粉碎，加4倍麦芽粉重量、温度为60℃的水，于55～60℃的水浴锅中保温糖化4h，过滤，获麦芽汁，用糖度计调节其糖度为10%，pH自然，真空抽滤，用高压灭菌锅在121℃灭菌20min。

1.2.3柿单宁的提取称取1kg的青柿果，破碎后加入无水甲醇打浆，加入1.43L无水甲醇，在室温下回流浸提14h，过滤。残渣再用0.57L无水甲醇浸提30min，过滤，合并滤液。用真空旋转蒸发仪蒸发浓缩至0.54L，浓缩液加入4～5倍体积的冰醋酸，沉淀单宁。沉淀物形成后，快速过滤。将过滤得到的沉淀溶解在0.86L的甲醇中，除去不溶于甲醇的果胶物。再用真空旋转蒸发仪蒸发浓缩至0.43L［9］。

1.2.4柿单宁凝胶固定化啤酒酵母菌的方法在30℃下，取2.5%明胶液20mL放入烧杯中，不断搅拌并缓慢的加入5mL 1%的PVA，再加入已活化的菌浓度为2.8×109cfu/mL的啤酒酵母菌菌悬液5mL，搅匀后，加入20mL 10%的柿单宁溶液，调整溶液pH为8.0，沉淀10min，待形成凝胶，酵母菌包埋后，分离包埋剂，用无菌蒸馏水冲洗包埋剂。将包埋剂12g（湿重）投入到麦芽汁培养基中进行发酵，测其表观发酵度。以上试液除柿单宁和啤酒酵母菌悬液之外，使用之前均需在115℃下灭菌15min。

1.2.5海藻酸钠-PVA复合材料固定化啤酒酵母称取1.25g的海藻酸钠于无菌小烧杯中，加入无菌去离子水少许，调成糊状，再加入剩余的水（总量一定），加热溶解并冷却至室温，配制成2.5%海藻酸钠溶液50mL。加入3g PVA，使PVA浓度达到6%，再与5mL啤酒酵母菌悬液混匀，用带5#针头的注射器将其以恒定速度滴到4%的CaCl2溶液中，浸泡约30min后，将凝胶珠移入500mL的三角瓶中，用无菌去离子水洗涤3次后，转入灭菌麦芽汁进行发酵［8］。

1.2.6柿单宁凝胶固定化的啤酒酵母菌发酵效果对比调整麦芽汁培养基pH为5.0、初始糖度为12%、固定化包埋的啤酒酵母菌的包埋量20（包埋剂和酵母菌的体积比）、培养温度为30℃，发酵36h后，测定游离酵母菌、柿单宁凝胶固定的酵母菌和常用的海藻酸钠PVA复合材料［10］固定的酵母菌发酵的速度，研究柿单宁凝胶固定的酵母菌的发酵效果。

1.2.7柿单宁凝胶固定化的啤酒酵母菌发酵条件研究

1.2.7.1柿单宁凝胶固定化的啤酒酵母菌发酵温度的确定分别将柿单宁凝胶固定化的啤酒酵母接入装有50mL初始糖度为10%，自然pH的麦芽汁的三角瓶中，置于20、25、30、35、40℃的培养箱中培养36h后，测定发酵液的糖度，计算真实发酵度和表观发酵度，确定固定化酵母菌发酵温度。

1.2.7.2pH对固定化啤酒酵母菌发酵的影响分别将柿单宁凝胶固定化的啤酒酵母菌接入50mL初始糖度为10%麦芽汁中，调整pH为3、4、5、6和7，置于30℃的培养箱中培养36h后，测定发酵液的糖度，计算真实发酵度和表观发酵度，确定固定化啤酒酵母菌发酵的适宜pH。

1.2.7.3包埋量对固定化啤酒酵母菌发酵影响制备包埋量分别为10、15、20、25、30（包埋剂和酵母菌菌悬液的体积比值）的固定化啤酒酵母菌，分别将柿单宁凝胶固定化的啤酒酵母菌接入装有50mL初始糖度为10%，自然pH麦芽汁的三角瓶中，置于30℃的培养箱中培养36h后，测定发酵液的糖度，计算真实发酵度和表观发酵度，确定固定化啤酒酵母菌的最适包埋量。

1.2.7.4初始糖度对固定化啤酒酵母菌发酵的影响分别将柿单宁凝胶固定化的啤酒酵母菌接入50mL自然pH麦芽汁中，调整初始糖度为6%、8%、10%、12%、14%和16%，置于30℃的培养箱中培养36h后，测定发酵液的糖度，计算真实发酵度和表观发酵度，确定固定化啤酒酵母菌发酵的最适初始糖度。

1.2.8固定化柿单宁凝胶啤酒酵母发酵条件正交实验为了对柿单宁凝胶固定化啤酒酵母的发酵条件进行深入研究，选择温度、溶液pH、包埋量、初始糖度四因素进行L9（34）正交实验，实验方法同1.2.4，正交实验因素水平见表1。以真实发酵度为指标，研究各因素对真实发酵度的影响，从而确定最佳的工艺条件。

表1　正交实验因素水平表Table 1　The factors and levels of orthogonal design

1.2.9菌悬液菌数和总糖含量测定菌悬液菌数测定用血球板计数法［7］；总糖含量的测定用斐林试剂法［10］。

1.2.10真实发酵速度的测定测定发酵前发酵液总糖的含量，发酵36h后，测定发酵液中残糖的含量，用下面公式来计算发酵速度：

1.2.11表观发酵速度的测定用阿贝折光仪测定发酵前后麦芽汁的糖度，并按下式计算其表观发酵度。

表观发酵度（%）=［（原始麦芽汁糖度-发酵后麦芽汁糖度）/原始麦芽汁糖度］×100

1.3数据处理方法

用DPS和Excel软件对实验结果进行统计分析和处理［11-14］。

2　结果与分析

2.1柿单宁凝胶固定化的啤酒酵母菌发酵效果研究

从图1可知，固定的酵母菌的发酵速度明显高于游离酵母（p＜0.05），在同样条件下，与游离酵母菌、常用的海藻酸钠-PVA复合材料包埋的酵母菌比较，柿单宁凝胶固定酵母菌发酵的速度最高，为96.05%，可见柿单宁包埋酵母菌具有很大的优势。因为活的酵母菌细胞高度密集于载体之上，并不断生长繁殖，形成高浓度的生物催化剂，从而大大加快了反应速度，使生产能力大幅度提高。固定化酵母是一种代谢异常的“工程菌”，与游离酵母细胞相比处于较高的代谢水平，在固定载体表面的固液界面上可以保持一个高浓度的营养物质水平，固定化改变了细胞的通透性，能使更多的营养物质进入细胞，使代谢加快，从而使得营养物质要比游离细胞消耗的快，呈现出固定化发酵的速度快于游离细胞的发酵速度。

图1　不同发酵类型下真实发酵速度的比较Fig.1　Comparation of real ferment rates under condition of different fermentation type

2.2柿单宁凝胶固定化的啤酒酵母菌发酵温度的确定

从图2可知，温度对发酵影响比较明显，在20～30℃范围内，随着温度的升高，发酵速度加快，当发酵温度为30℃时发酵速度最大，超出30℃，发酵速度减慢，但变化幅度不大。由此可知，在一定温度范围内，高温有利于提高酵母菌的繁殖活力，20℃以下发酵速度最慢，啤酒发酵的最适合温度介于20～30℃之间，如果发酵温度过高，则会加速酵母的自溶，自溶后产生大量的氨基酸，会引起高级醇的增加，最后导致酒变苦，且会导致菌种的突变和退化；如果发酵温度过低，发酵能力降低，能发酵麦芽三糖的酵母逐渐退化为不能发酵麦芽三糖的菌［15-16］。

图2　温度对固定化啤酒酵母菌发酵的影响Fig.2　Effect of temperature on fermentation with immobilized Saccharomyces cerevisiae

2.3pH对固定化啤酒酵母菌发酵影响

固定的啤酒酵母菌在不同pH的麦芽汁中发酵效果见图3。从图3可知，麦芽汁pH对发酵影响比较明显，随着发酵液pH的增大，发酵速度加快，pH为5时，发酵速度最大，pH大于5，发酵速度减慢，但比较平稳。pH影响细胞质膜的通透性、膜结构的稳定性和物质的溶解性来影响物质的吸收［8］。在偏碱性的条件下OH-占优势，水合氢离子和OH-对营养物质的溶解度和解离状态、细胞表面电荷平衡等方面产生重大影响，因而pH为7时发酵速度较慢。在酸性条件下H+可以与营养物质结合，并能从可交换的结合物或细胞表面置换出某些阳离子，从而影响细胞结构的稳定性。

图3　pH对固定化酵母菌发酵的影响Fig.3　Effect of pH on fermentation with immobilized Saccharomyces cerevisiae

2.4包埋量对固定化啤酒酵母菌发酵的影响

包埋量不同，对麦芽汁的发酵速度不同，结果见图4。由图4可知，包埋量越大，酵母含量越多，发酵速度越快，但验证实验发现，若包埋量过大，麦芽汁最终发酵的酒精度则随包埋量的增加而减少，故选择包埋量时要同时考虑发酵速度和酒精转化率。

图4　包埋量对固定化啤酒酵母菌发酵的影响Fig.4　Effect of embedding quantityon fermentation with immobilized Saccharomyces cerevisiae

2.5初始糖度对固定化啤酒酵母菌发酵的影响

选择初始糖度不同的麦芽汁，固定化啤酒酵母菌发酵，结果见图5。由图5可知，当初始糖度低于12%时，发酵速度随糖量的增加而增加；但当糖度超过12%时，由于凝胶内底物浓度过高而抑制酵母的生长，发酵速度反而下降。因此采用初始糖度12%的麦芽汁发酵为宜。

图5　初始糖度对固定化啤酒酵母菌发酵的影响Fig.5　Effect of initial sugar degree on fermentation with immobinzed Saccnaromyces cerevisiae

2.6固定化啤酒酵母菌发酵条件的优化

为了对柿单宁凝胶固定化的啤酒酵母的发酵条件进行深入研究，选择温度、溶液pH、包埋量和初始糖度4因素进行L9（34）正交实验，实验方法见1.2.4。以真实发酵度为考察指标，研究各因素对真实发酵度的影响，从而确定最佳的工艺条件。实验结果见表2。

表2　正交实验设计及结果Table 2　The Results of the orthogonal experiment

从表2可以看出各因素对固定化真实发酵速度影响的主次顺序依次为：溶液pH＞初始糖度＞包埋量＞温度，发酵条件最优组合为A2B1C1D3，即温度30℃、pH4.0、包埋量为10（包埋剂和酵母菌的体积比值）、初始糖度为14%。采用最佳发酵条件进行验证实验，真实发酵速度可达97.2%，均高于表2中所有组合的发酵速度。故本实验最佳发酵工艺为温度30℃、pH4.0、包埋量为10（包埋剂和酵母菌的体积比）、初始糖度为14%。

3　结论

3.1实验可知制备柿单宁凝胶条件温和，增大了包埋后酵母菌的活性，为柿单宁凝胶的广泛使用提供了可能。

3.2柿单宁凝胶固定的啤酒酵母菌与用游离酵母菌和PVA-海藻酸钠复合材料包埋的酵母菌相比，真实发酵度高，达96.05%；在研究柿单宁凝胶固定的啤酒酵母菌的适宜发酵温度、pH、包埋量和初始糖度的单因素实验基础上，通过正交实验确定了包埋剂对麦芽汁的最佳发酵条件为包埋量10（包埋剂和酵母菌的体积比），麦芽汁初始糖度14%，pH为4.0，发酵温度为30℃，此条件下进行发酵，真实发酵速度可达97.2%。

［1］王立娜，赵瑞雪，郑笑秋，等.固定化啤酒酵母菌吸附Pb2+的研究［J］.长春理工大学学报，2009，32（1）：160-164.

［2］张亮亮，汪咏梅，徐曼，等.植物单宁化学结构分析方法研究进展［J］.林产化学与工业，2012，32（3）：107-115.

［3］顾海峰，李春美，徐玉娟.柿子单宁的制备及其抗氧化活性研究［J］.农业工程学报，2007，23（5）：241-245.

［4］Inoue K，Kawakita H，Ohto K，et al.Adsorptive removal of uranium and thorium with a crosslinked persimmon peel gel［J］. Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry，2006，267（2）：435-442.

［5］Ogata T，Nakano Y.Mechanisms of gold recovery from aqueous solutions using a novel tannin gel adsorbent synthesized from natural condensed tannin［J］.Water Research，2005，39：4281-4286.

［6］Wen Li，Yankui Tang，Yutao Zeng，et al.Adsorption behavior of Cr（VI）ions on tannin-immobilized activated clay［J］.Chemical Engineering Journal，2012，193：88-95.

［7］李娟，廖学品，舒星旭，等.胶原纤维吸附剂对虎杖提取物中鞣质的选择性去除［J］.中国中药杂志，2010，35（5）：583-587.

［8］沈萍.微生物学［M］.第二版.北京：高等教育出版社，2003：131.

［9］Hai-Feng Gu，Chun-Mei Li，Yu-juan Xu，et al.Structural features and antioxidant activity of tannin from persimmon pulp［J］.Food Research International，2008，41：208-217.

［10］张明霞.猕猴桃酵母固定化技术的研究［D］.杨陵：西北农林科技大学，2003.

［11］胡明方.食品分析［M］.重庆：西南师范大学出版社，1992：24-25.

［12］唐启文，冯明光.实用统计及其DPS数据处理系统［M］.北京：科学出版社，2002.

［13］王钦德，杨坚.食品实验设计与分析［M］.北京：中国农业大学出版社，2003.

［14］袁志发，周静芋.实验设计与分析［M］.北京：高等教育出版社，2000.

［15］程江峰，何国庆.固定化酵母细胞啤酒连续后发酵工艺条件的优化［J］.中国食品学报，2004，4（2）：31-34.

［16］Itsuki Watanabe，Naonori Miyata，Riki Shiroma，et al.Akira AndoEthanolproductionbyrepeated-batchsimultaneous saccharification and fermentation（SSF）of alkali-treated rice straw using immobilized Saccharomyces cerevisiae cells［J］. Bioresource Technology，2012，123：695-698.

Study on fermentation process of Saccharomyces cerevisiae immobilized by persimmon tannin gel

SUN Xiao-yuan1，2，ZHANG Bao-shan1，2，*，LIU Sha-sha1，LUO Teng1，HUANG Wen3
（1.College of Food Engineering and Nutritional Science，Shaanxi Normal University，Xi’an 710119，China；2.The Fruit and Vegetable Processing Technology Research Center in Shaanxi Province，Xi’an 710119，China；3.Northwest University of Politics and Law Business School，Xi’an 710119，China）

Objective：To compare the free Saccharomyces cerevisiae and immobilized Saccharomyces cerevisiae with persimmon tannin gel and immobilized Saccharomyces cerevisiae within PVA-sodium alginate and obtain a optimal set of parameters for wort fermentation with Saccharomyces cerevisiae embedded with persimmon tannin gel.Methods：Extract persimmon tannin from persimmon and mix it with crosslinking agent.Then embed Saccharomyces cerevisiae and use immobilized Saccharomyces cerevisiae with persimmon tannin gel for formentation.On the basis of single factor experiment，through the orthogonal experiment to study the effects of different parameters such as temperature，immobilized rate，pH，and initial sugar degree to the fermentation properties of immobilized Saccharomyces cerevisiae.Results：Compared with other materials the real fermentation rate of the immobilized Saccharomyces cerevisiae with persimmon tannin gel achieved 96.05%，which was the maximum value.The best fermentation conditions were as follows：immobilizing quantity 10，initial sugar degree 14%，pH4 and fermentation temperature 30℃.Under the optimal conditions，the real fermentation rate achieved 97.2%.Conclusion：The conditions of persimmon tannin gel preparation were mild，it increased the activity of embeded Saccharomyces cerevisiae and provided a possibility for the wide use of this materials.

persimmon tannin；gel；immobilized Saccharomyces cerevisiae；fermentation

TS201.1

A

1002-0306（2015）12-0142-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.021

2014－09－24

孙肖园（1988-），女，硕士研究生，研究方向：食品发酵与质量控制。

张宝善（1968-），男，博士，教授，主要从事食品微生物及食品发酵方面的研究。

陕西师范大学中央高校科研发展专项项目资助（GK201405006）；西安市科技计划项目（SF1234-2）。