高压脉冲电场对发酵型橙醋的杀菌及陈酿作用

孙茜妍，杨瑞金，吴　梨，赵　伟

（江南大学食品学院，江苏无锡214122）

高压脉冲电场对发酵型橙醋的杀菌及陈酿作用

孙茜妍，杨瑞金*，吴梨，赵伟

（江南大学食品学院，江苏无锡214122）

用高压脉冲电场（PEF）对发酵型橙醋进行处理，研究了不同处理条件（时间、频率、脉宽和场强）下PEF对橙醋的杀菌效果，并与热处理对橙醋杀菌效果以及理化性质的影响进行了比较。同时通过对PEF作用的新酿橙醋及经1个月自然陈酿橙醋的风味成分的分析比较，考察PEF技术加速橙醋陈酿的可行性。结果显示，PEF与热处理相比，会对橙醋的理化性质有更好的保护作用；在最优杀菌条件（300μs、200Hz、2μs、25kV/cm）下，PEF对腐败菌的杀菌效果可达到5.24个对数，高于传统热处理杀菌的5.03个对数。GC-MS检测结果表明，经PEF处理的橙醋主要风味物质乙酸乙酯、乙酸异戊酯、3-甲基-1-丁醇、3-羟基-2-丁酮、苯乙醇等都有不同程度的增加，与自然陈酿趋势相同。研究结果表明PEF对橙醋具有良好的杀菌效果，并具有加速陈酿作用，在高品质醋加工中的应用前景非常广阔。

高压脉冲电场（PEF），杀菌，橙醋，陈酿

果醋是以水果或其加工下脚料为原料，经过微生物发酵酿制而成的一种酸味调味品，其兼具了水果丰富的营养价值和优良的风味［1］。果醋中保留了大部分水果原有的营养成分，除了具有一般食醋的抗菌杀菌、降血压、增食欲、促消化、保护皮肤等作用外，还兼有水果的保健功能，如：苹果醋能够补中益气、生津开胃；梨醋能够生津润燥、清热化痰等［2-3］。

在果醋酿造过程中，传统杀菌工艺采用巴氏杀菌（60℃，5min）或“煎醋”即煮沸的方式，通常会造成风味物质和营养成分被破坏［4］。新酿制成的醋风味粗糙，口感刺激，且不稳定，所以必须进行陈酿。自然陈酿是发酵结束后，经过一段时间的贮存，使得醋中的物质发生缓慢复杂的相互作用，最终获得稳定良好的风味［4］。但是此陈酿方法周期较长，例如镇江香醋的国家标准中规定镇江香、陈醋的陈酿时间为6个月以上［5］。为了加速陈酿，经常采用人工催陈技术、包括红外技术、超声波技术和超高压技术等［6］。

高压脉冲电场（PEF）是近年来被广泛研究的非热加工技术，大量的研究表明其对果汁及其加工产品有很好的杀菌效果，且能较好保持产品品质［7-8］。同时，国内外已有研究表明PEF可用于酒类的陈酿［9-12］，但尚无其对果醋杀菌和催陈的报道。

本研究采用PEF处理新酿制的橙醋，考察其杀菌效果，并通过气质联用技术（GC-MS）测定处理前后挥发性风味物质，观察PEF处理对加速陈酿的效果。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

赣南脐橙11月采自江西赣州，4℃保存；安琪葡萄酒干酵母BV818安琪酵母公司；恶臭醋酸杆菌浑浊变种AS1.41中国工业微生物菌种保藏中心；OXOID OSA橙汁琼脂培养基北京拜迪尔生物有限技术公司。

YZ-E8榨汁机九阳股份有限公司；ZQTY-50型恒温振荡培养箱上海知楚仪器公司；OSU-4L型高压脉冲电场系统美国俄亥俄州立大学；电热恒温培养箱上海一恒科学仪器有限公司；LXJ-IIB型离心机上海安亭科学仪器厂；FE20型实验室pH计、FE30型实验室电导率仪梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；WYA-2W型双目阿贝折光仪上海索光光电技术有限公司；TSQ Quantum XLS三重四极杆气相质谱联用仪美国赛默飞世尔公司；UltraScan Pro1166型高精度分光测色仪Hunterlab公司

1.2实验方法

1.2.1发酵工艺流程

1.2.2橙醋细菌接种及细菌总数检测方法接种1%腐败的橙醋于新醋中，室温培养24h，控制初始菌落总数在106～108cfu/mL。细菌总数检测采用平板菌落计数法。将1mL样品以十倍递增法用生理盐水稀释成10-2～10-6稀释度的稀释液，取1mL稀释液于灭菌平板中，倒入OSA培养基15～20mL，置于30℃恒温培养箱中培养，48h后计数。

1.2.3PEF处理时间对杀菌效果的影响设置场强为20kV/cm，脉宽2μs，频率200Hz，处理时间分别为150、300、450、600μs，检测处理前后橙醋的细菌总数，计算致死对数，计算公式如下：

式中：N：致死对数，cfu/mL；n：处理后样品菌落总数；n0：未处理空白菌落总数。

1.2.4PEF处理频率对杀菌效果的影响PEF处理频率为100、150、200Hz（机器操作范围100～200Hz），场强20kV/cm，时间300μs，脉宽2μs，按公式（1）计算致死对数。

1.2.5PEF处理脉宽对杀菌效果的影响PEF处理脉宽为1.0、1.5、2μs（机器操作范围1～2μs）、场强20kV/cm，时间300μs，频率200Hz，按公式（1）计算致死对数。

1.2.6PEF处理场强对杀菌效果的影响PEF处理场强为15、20、25kV/cm（机器操作范围15～25kV/cm），时间300μs，脉宽2μs，频率200Hz，按公式（1）计算致死对数。

1.2.7橙醋热杀菌效果测定将新酿橙醋于60℃水浴中保持5min，立即冷却，按公式（1）计算致死对数。

1.2.8GC-MS参数条件及分析分别测定未处理新醋、自然陈酿一个月、PEF最优条件处理的橙醋挥发性风味物质。

1.2.8.1色谱柱DB-WAX柱（60mm×0.25mm，0.25μm）。

1.2.8.2风味物质萃取条件取4mL样品和1.0g分析纯NaCl加入到15mL顶空瓶中，插入50μm CAR/PDMS萃取头，40℃振摇萃取25min。

1.2.8.3色谱条件CAR/PDMS萃取头解析10min，进样口温度280℃，载气为高纯氦气，流量1.1mL/min，不分流。

1.2.8.4程序升温起始温度35℃，保持3min，以5℃/min的速度升至120℃，保持5min，再以10℃/min的速度升至240℃，保持5min。

1.2.8.5质谱条件5973型四极杆质谱仪，接口温度250℃，电子轰击（EI）离子源，电子能量为70eV，电子倍增器电压为1353V，离子源温度为230℃，四极杆温度为150℃，质量扫描范围33～350amu。

1.2.9理化指标测定方法pH：使用pH计直接测定；电导率：使用电导率仪直接测定；可溶性固形物：使用阿贝折光仪直接测定；色差：以未处理橙醋为对照，用高精度分光测色仪测定PEF处理及热处理后的色差；As、Pb的含量：橙醋中As的含量依照GB 5009.12-2010《食品中铅的测定》［13］测定，Pb的含量依照GB/T 5009.11-2003《食品中总砷及无机砷的测定》［14］测定。

1.2.10数据分析利用SPSS 19.0对数据进行统计和方差分析（p＜0.05），每个样品做三次平行。

2　结果与分析

2.1PEF处理条件对橙醋杀菌效果的影响

2.1.1时间PEF处理时间对橙醋中细菌的致死对数的考察如图1所示。由图1可知，致死对数随处理时间的延长而增大，处理300μs可达4.33个对数，而后无显著差异。与廖小军［15］的研究结果一致，严志明［16］的研究也表明在PEF对橙汁的杀菌过程中，随着时间的延长，致死对数越高。因此，选择300μs作为后续研究的处理时间。

2.1.2频率由图2可知，随着PEF处理频率的加大，致死对数增大。当频率为200Hz时，可达4.33个对数。说明处理频率的升高对橙醋的杀菌效果加强有明显的作用，与Mosqueda等［17］利用PEF对西瓜汁进行杀菌的结论一致。因此选用200Hz作为最优PEF处理频率。

图2　不同PEF处理频率下橙醋中的微生物致死对数Fig.2　Log10microbial reduction in the orange vinegar treated by PEF under different frequency

2.1.3脉宽研究者们在研究PEF对沙门氏菌［18］和植物乳杆菌［19］的杀菌效果时发现，脉宽的改变对杀菌效果有显著的影响。PEF脉宽改变对橙醋中微生物的致死对数随脉宽增加呈先减小后增加的趋势（图3），当脉宽为2μs时，效率最高。因此选用2μs为后续研究所用脉宽。

图3　不同PEF处理脉宽下橙醋中的微生物致死对数Fig.3　Log10microbial reduction in the orange vinegar treated by PEF under different pulse widths

2.1.4场强在不同PEF处理场强下，致死对数的变化如图4所示。在场强为15、20、25kV/cm时，致死对数分别为4.18、4.38和5.24个对数。McDonald等［20］对橙汁进行PEF杀菌处理，结果显示场强由30kV/cm增加到50kV/cm时，致死对数增加了1.45个对数。Gurtler等［21］的研究表明，在13.1、19.7、23.7kV/cm的场强下，PEF对橙汁的杀菌效果分别为1.0、2.4、3.4个对数。说明加大电场强度对杀菌效果有积极作用［15］。最终确定PEF杀菌最佳条件为处理时间300μs、频率200Hz、脉宽2μs、场强25kV/cm。

图4　不同PEF处理场强下橙醋中的微生物致死对数Fig.4　Log10microbial reduction in the orange vinegar treated by PEF under different electric field intensities

2.2PEF处理对橙醋理化性质的影响

根据国标［22］中对食醋理化指标的规定以及前人对橙汁杀菌前后品质的比较［23，15］，选择电导率、pH、色差、可溶性固形物含量、As和Pb的含量为理化指标，对PEF处理和热处理的橙醋进行对比，结果如表1所示。

表1　不同处理方式对橙醋理化性质的影响Table 1　The effects of different kinds of processing on the physicochemical properties of the orange vinegar

优化的PEF处理条件下的杀菌致死对数为5.24个对数，超过传统热处理所达到的5.03个对数。在电导率和pH方面，两种处理方式均对橙醋没有显著的影响（p＞0.05）。然而，热处理所产生的色差程度显著高于PEF处理（p＜0.05），说明PEF对橙醋有着良好的护色效果。热处理会造成橙醋可溶性固形物含量下降，导致营养物质的损失。As的含量处理前后均远低于国家标准（1mg/L）的限量范围，Pb未检出。由于PEF可利用瞬间产生的高压脉冲杀灭细菌，整个过程几乎不产生热量［24］，所以既能达到杀菌要求，又对橙醋理化性质有更好的保护，是一种比热杀菌更有优势的非热杀菌方式。

2.3PEF处理对橙醋的陈酿效果

2.3.1橙醋的挥发性风味物质通过GC-MS分析，得到未处理的橙醋的总离子流色谱图（图5）。利用美国国家标准谱图库（NIST-MS，2005）自动检索，鉴定出了44种挥发性化学物质，并通过峰面积归一化法计算出这些物质的相对含量（表2）。其中包含醇类物质11种，醛类物质6种，酸类物质2种，酯类物质13种，其他物质12种。其中含量较高的有乙酸乙酯（20.93%）、乙酸（20.06%）、甲酸甲酯（6.09%）、辛酸（5.30%）、3-甲基-1-丁醇（4.8%）、乙酸异戊酯（3.83%）、苯乙醇（3.7%）、乙醇（2.72%）、2-乙酸苯乙酯（1.58%）。通过比对张霁红［25］、袁小单［26］和刘杨岷等［28］对苹果醋、柿醋和食醋的研究发现，乙酸乙酯、乙酸、甲酸甲酯、辛酸、乙酸异戊酯、3-甲基-1-丁醇、苯乙醇、乙醇、2-乙酸苯乙酯是果醋的主要风味物质。

表2　未处理的橙醋挥发性物质成分Table 2　The volatile compounds of the orange vinegar

比较可鉴定的44种风味物质总量在其总体挥发性物质中所占的比例，发现PEF处理后（93.38%）与自然陈酿（91.23%）相对于未处理中风味物质总量（84.57%）有所增加，说明陈酿过后总体挥发性物质的种类有所减少，使得可鉴定的主要风味物质相对含量增加，让橙醋的特征风味更加突出。

2.3.2PEF处理对橙醋风味物质的影响

2.3.2.1总醇、总醛、总酸和总酯如表3所示总酸和总醇在自然陈酿及PEF处理后都有明显的上升，而总酯的相对含量在经过PEF处理后明显高于自然陈酿，但总醛未发生显著变化。殷涌光等采用高压脉冲电场催陈一年白酒，其总酸、总醇、总醛、总酯的变化趋势均与自然陈酿相同，且总酯含量经处理后明显增高，并高于六年陈酿水平［9］。Bin Zhang等利用PEF催陈白兰地，其乙酸乙酯含量上升了16.6%［29］，说明PEF处理对酯化反应的形成有促进作用。

图5　未处理橙醋挥发性成分GC-MS总离子流色谱图Fig.5　Total ion current of volatile compounds from the original orange vinegar

表3　不同处理方式下四类橙醋香气成分的相对含量Table 3　The relative contents of four kinds of the volatile compounds after different treatments

2.3.2.2代表性风味物质表4所示为橙醋风味物质中含量较高的主要特征风味物质，包括乙酸乙酯、乙醇、乙酸异戊酯和3-甲基-1-丁醇等，这些物质构成了醋的独特风味，也是陈酿过程中的关键风味物质［26，28］。

表4　不同处理方式下橙醋香气主要成分及其相对含量Table 4　The relative concentrations of the major volatile compounds after different processing treatments

乙酸乙酯和乙酸是相对含量最大的物质。自然陈酿和PEF处理后的橙醋风味物质中，乙酸所占比例均明显增大，产生更加浓郁的醋酸味。与新醋相比，自然陈酿后乙酸乙酯含量并无明显差异，而乙醇含量上升，但PEF处理后乙酸乙酯有显著上升（p＜0.05），乙醇含量无明显变化。这说明PEF处理能够促进橙醋中乙酸和乙醇的酯化反应，使得乙酸乙酯的风味更佳明显，橙醋口感更绵柔，更具有后熟感。同时乙酸异戊酯也与乙酸乙酯有相同的变化趋势，其特殊果香更赋予了PEF处理后橙醋良好的风味，也印证了PEF处理对加速橙醋陈酿效果的积极作用。2-乙酸苯乙酯相对含量较小，自然陈酿与PEF处理后均未显示出明显的变化。辛酸是具有特殊香气的化合物，常用作香料，在陈酿和PEF处理后均有不同程度的下降。

呈苹果白兰地香气的3-甲基-1-丁醇、紫丁香气味的α-松油醇和玫瑰香气的苯乙醇都是发酵过程中产生的杂醇油，一定量的杂醇油对食醋风味的成熟有关键的作用。这三种物质在自然陈酿和PEF处理后都显示出了相同的变化趋势，PEF处理后的相对含量变化程度更大，说明PEF较自然陈酿有快速催陈的效果。而带有牛奶香气的3-羟基-2-丁酮在两种条件下均无明显变化且相对含量都极少，该物质可以呈现蜂蜜香味，使得橙醋更具香甜味。

3　结论

3.1经过PEF处理条件优化，确定最佳杀菌条件为时间300μs、频率200Hz、脉宽2μs、场强25kV/cm。杀菌效果可达5.24个对数，超过传统热处理杀菌效果，且对橙醋理化品质和风味有更好的保护作用。PEF处理具有替代热处理作为橙醋杀菌工艺的潜质和优势。

3.2研究发现，PEF在杀菌过程的同时，可对橙醋的陈酿产生加速作用。经过GC-MS分析，PEF处理后橙醋风味物质变化趋势与自然陈酿基本一致，且酯类物质的增加程度大于自然陈酿，使得橙醋香味更浓郁口感更醇厚。而本文仅对PEF处理后风味物质的客观变化进行描述，其加速陈酿的机制有待进一步研究。

［1］王春霞.新一代健康饮品—果醋［J］.食品工业科技，2002（4）：78-79.

［2］曹雪丹.柑橘果醋研究进展［J］.浙江柑橘，2009，26（3）：32-35.

［3］徐清萍，敖宗华，陶文沂.食醋功能研究进展（上）［J］.中国调味品，2003，12：11-13.

［4］张宝善.食醋酿造学［M］.北京：科学出版社，2014：299-315.

［5］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB 18623－2011地理标志产品镇江香醋国家标准［S］.2011.

［6］黄文韬，侯红萍.食醋人工催陈的研究进展［J］.中国调味品，2013（8）：1-3.

［7］Hodgins A M，Mittal G S，Griffiths M W.Pasteurization of fresh orange juice using low-energy pulsed electrical field［J］. Journal of Food Science，2002，67（6）：2294-2299.

［8］Buckow Roman，Ng Sieh，Toepfl Stefan.Pulsed electric field processing of orange juice：A review on microbial，enzymatic，nutritional，and sensory quality and stability［J］.Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety，2013，12：455-467.

［9］殷涌光，郝桂丹，石晶.高电压脉冲电场催陈白酒的实验研究［J］.酿酒科技，2005，138（12）：47-50.

［10］刘学军，殷涌光，范松梅，等.高压脉冲电场催陈葡萄酒香气成分变化的GC-MS分析［J］.食品科学，2006，27（12）：654-657.

［11］Puertolas E，Saldana G，Condon S，et al.Evolution of polyphenolic compounds in red wine from Cabernet Sauvignon grapes processed by pulsed electric fields during aging in bottle［J］.Food Chemistry，2012，119（3）：1063-1070.

［12］Puertolas E，Saldana G，Alvarez I，et al.Effect of Pulsed Electric Field Processing of Red Grapes on Wine Chromatic and Phenolic Characteristics during Aging in Oak Barrels［J］.Journalof Agricultural and Food Chemistry，2010，58（4）：2351-2357.

［13］中华人民共和国卫生部.食品安全国家标准-食品中铅的测定［S］.2010.

［14］中华人民共和国卫生部.食品中总砷及无机砷的确定［S］. 2003.

［15］廖小军，钟葵，王黎明，等.高压脉冲电场对橙汁大肠杆菌和理化性质的影响效果［J］.食品科学，2003，24（6）：59-61.

［16］严志明.高压脉冲电场对微生物的致死动力学研究以及在橙汁中的应用［D］.福州：福建农林大学，2007.

［17］Mosqueda-Melgar J，Raybaudi-Massilia R M，Mart’ınBelloso O.Influence of treatment time and pulse frequency on Salmonella enteritidis， EscherichiacoliandListeriamonocytogenes populations inoculated in melon and watermelon juices treated bypulsedelectricfield［J］.International.JournalofFood Microbiology，2007，117（2）：192-200.

［18］Korolczuk J，Rippoll Mc，Keag J，et al.Effect of pulsed electric field processing parameters on Salmonella enteritidis inactivation［J］.Journal of Food Engineering，2006，75：11-20.

［19］Abram F，Smelt J P P M，Bos R，et al.Modelling and optimization of inactivation of Lactobacillus plantarum by pulsed electric field treatment［J］.Journal of Applied Microbiology，2003，94：571-579.

［20］McDonald C J，Lloyd S W，Vitale M A，et al.Effect of pulsed electric fields on microorganisms in orange juice using electric field strengths of 30 and 50 kV/cm［J］.Journal of Food Science， 2000，65：984-989.

［21］Gurtler J B，Rivera R B，Zhang H Q，et al.Selection of surrogate bacteria in place of E-coli O157∶H7 and Salmonella Typhimurium for pulsed electric field treatment of orange juice［J］.International Journal of Food Microbiology，2010，139（1-2）：1-8.

［22］中华人民共和国卫生部.GB 2719-2003中国食醋卫生标准［S］.2003.

［23］康雅.高压脉冲电场杀菌技术在橙汁中的应用［J］.饮料工业，2010（7）：8-10.

［24］Ayhan Z，Yeom H W，Zhang Q H，et al.Flavor，color，and vitamin C retention of pulsed electric field processed orange juice in different packaging materials［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2001，49（2）：669-674.

［25］张霁红，张永茂，曾朝珍，等.发酵苹果醋挥发性成分的GC/MS分析［J］.酿酒科技，2013（5）：94-96.

［26］袁小单，严蕊，马永昆，等.基于SPME-GC-MS的超高压镇江香醋香气变化分析［J］.食品科技，2012，37（11）：263-269.

［27］鲁周民，郑皓，刘月梅，等.自然发酵柿果醋香气成分的GC/MS分析［J］.食品与发酵工业，2008，34（8）：150-153.

［28］刘杨岷，张家骊，王利平，等.食醋风味成分比较研究［J］.食品与机械，2005，21（5）：40-42.

［29］Zhang Bin，Zeng Xin An，Sun Da Wen，et al.Effect of electric field treatments on brandy aging in Oak Barrels［J］.Food Bioprocess Technology，2013（6）：1635-1643.

Effects of pulsed electric field on the sterilization and aging of fermented orange vinegar

SUN Qian-yan，YANG Rui-jin*，WU Li，ZHAO Wei
（School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Fermented orange vinegar was treated by pulsed electrical field（PEF）and the sterilization effect and physicochemical were studied under different PEF treatment conditions including time，frequency，pulse width and electric field intensity.Furthermore，a comparison was made with thermal pasteurization.In addition，the flavor compounds of untreated，PEF treated and naturally aged orange vinegar were analyzed to investigate the feasibility of accelerating aging by PEF.The best sterilizing effect was 5.24log reduction at treatment time of 300μs，frequency of 200Hz，pulse width of 2μs and electric field intensity of 25kV/cm，which was better than that of the thermal pasteurization.PEF processing also had a better protective effect on the physicochemical properties.GC-MS showed that the major flavor compounds such as ethyl acetate，isoamyl acetate，3-methyl-1-butanol，acetoin，phenethyl alcohol increased at different levels having the same tendency as natural aging. The PEF treatment had good influence on sterilization and aging of the fermented orange vinegar and it had a broad application prospect in the processing of high-qualified vinegar.

pulsed electrical field（PEF）；sterilization；orange vinegar；aging

TS255.4

A

1002-0306（2015）12-0133-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.019

2014－12－01

孙茜妍（1990－），女，硕士研究生，研究方向：食品加工与配料。

杨瑞金（1964-），男，博士，教授，研究方向：食品加工新技术。

国家自然科学基金面上项目（31271947）。