苏丹型埃博拉病毒焦磷酸测序方法的建立

赵永刚，邹艳丽，张永强，吴晓东，王清华，王志亮

（中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛　266032）

苏丹型埃博拉病毒焦磷酸测序方法的建立

赵永刚，邹艳丽，张永强，吴晓东，王清华，王志亮

（中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛266032）

［目的］ 本研究旨在通过对埃博拉病毒进行序列信息分析的基础上，利用焦磷酸测序技术对苏丹型埃博拉病毒进行快速检测和鉴定。［方法］ 通过序列信息比对，设计苏丹型埃博拉病毒基因保守区段的扩增引物及测序引物。通过人工方法合成一段基因序列，PCR扩增目的基因片段，经体外转录制备cRNA，RT-PCR扩增目的基因片段，采用焦磷酸测序技术针对目的基因进行保守核苷酸区段的测序分析。［结果］ 通过序列信息比对寻找到苏丹型埃博拉病毒基因型的核苷酸保守区段，经焦磷酸测序后能进一步确证毒株的序列信息为苏丹型埃博拉病毒。经过与华大基因公司进行Sanger法测序比较，结果完全一致。［结论］ 基于序列分析的焦磷酸测序技术可以作为进一步确证方法使用。

苏丹型埃博拉病毒；序列比对；焦磷酸测序

近几年，外来动物疫病传入我国的风险不断上升，随着小反刍兽疫等外来动物疫病的发生，非洲猪瘟、尼帕、埃博拉等外来动物疫病步步紧逼我国。至今未查明其自然宿主动物通过与病人接触或者通过院内感染传播的埃博拉出血热于1976年首次出现［1］，很快以其高度传染性的暴发流行和高度致死性引起研究者极大关注，并引发了对埃博拉病毒及埃博拉出血热的一系列研究。

埃博拉出血热（Ebola hemorrhagic fever， EBHF）是由埃博拉病毒（Ebola virus，EBOV ）引起的人类和灵长类严重出血热疾病［2～6］，因EBOV首次是1976年在扎伊尔北部的埃博拉河流附近一个名叫杨博科的小村庄发现，故命名为埃博拉病毒和埃博拉出血热。

EBOV 属丝状病毒科（Filoviridae），与马尔堡病毒（Marberg virus） 共同构成丝状病毒属（Filovirus）。根据发现地点的不同 EBOV 可分为五个亚型，即埃博拉病毒-扎伊尔型（EBOV-Z）、埃博拉病毒-苏丹型（EBOV-S）、埃博拉病毒-莱斯顿型（EBOV-R）、埃博拉病毒-科特迪瓦型（EBOV-C）［7］和埃博拉病毒-本迪布焦型（EBOV-B）［8］。不同亚型的毒力各不相同，其对人类毒力的强弱顺序为：EBOV-Z＞EB0V-S＞EBOV-B＞EBOVC＞EBOV-R［8-9］。其中扎伊尔型、苏丹型、本迪布焦型、科特迪瓦型对人类有致病性，莱斯顿型仅在非人灵长类中引发疾病和死亡，人类也可能感染这种病毒从而成为无症状的病毒携带者［10-11］。世界卫生组织已将EBOV列为对人类危害最严重的病毒之一，即第4级病毒。试验操作要求必须在P4级高度安全实验室中进行［12］。2009年菲律宾发生猪感染莱斯顿型病毒并传染给人的疫情［13］，目前，我国尚没有埃博拉病毒感染或输入的报道，因此需要高度重视，并做好检测和防控的技术储备。

埃博拉病毒可以人-人传播，对人类危害极大，易被恐怖分子用作生物战剂。《国际禁止生物武器公约》已将 EBOV 列为潜在的致死性生物试剂，应引起高度重视。深入研究埃博拉病毒的致病机制及建立埃博拉病毒检测方法，对预防和控制埃博拉出血热具有非常重要的意义。

焦磷酸测序技术（Pyrosequencing）是近几年发展起来的一种能够进行定量序列测定的新技术，具有高通量、快速、敏感等特点。目前该技术在物种鉴定、病毒快速鉴定和分型、微生物的检测等方面已有广泛的应用［14］。本研究根据埃博拉病毒基因序列的保守性，建立了埃博拉的PCR-焦磷酸测序检测方法。

1　材料

1.1材料

苏丹型埃博拉病毒L基因保守区段由大连宝生物工程有限公司合成，由中国动物卫生与流行病学中心保存。

1.2主要试剂和仪器

Transcriptor One-Step RT-PCR Kit，体外转录试剂盒购自Promega公司；IDEXX BVDV Ag Serum Plus病原检测试剂盒购自IDEXX公司；Pyro Gold SQA Reagents 1×96 Pyromark ID购自Biotage AB公司；PyroMark Q96 MD仪器购自QIAGEN。

2　方法

2.1引物设计

选取GenBank中EBOV的毒株及其登录号Reston Ebola virus（AF522874.1）、Sudan Ebola virus EBOV-S-2004（EU338380.1）、Zaire Ebola virus strain Zaire 1995（AY354458）等100多条核苷酸序列，经Megalign比对，选出L基因高度保守且特异核苷酸区域，运用PSQ Assay Design软件进行分析，设计一对扩增引物和一条测序引物（表1，2），其中通用引物的下游引物在5端采用生物素标记。引物均由大连宝生物工程技术服务有限公司合成。

表1 扩增引物及序列

表2 测序引物及序列

2.2阳性克隆质粒的构建

以合成的L基因为模板，用含有T7启动子的扩增引物EBOV3/EBOV2（Biotin）扩增EBOV-S L基因保守区。反应体系为：模板1μL，PCR Mix 25μL，上下游引物各2μL，最后添加灭菌dd H2O至50μL。反应条件为：95℃预变性 5min；94℃变性 30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸7min。预期扩增片段长度为274bp。PCR结束后 ，进行 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，用胶回收试剂盒切胶回收目的条带，并克隆到pGEM-T载体，转化大肠杆菌Ecoli JM109感受态细胞。经蓝白斑筛选，PCR鉴定获得含目的基因片段的重组质粒，纯化后并测序。-20℃保存备用 。

2.3体外转录

2.3.1体外转录模板的制备

以构建的阳性克隆质粒为模板，T7启动子的扩增引物EBOV3， EBOV2为引物扩增的目的片段即为体外转录的模板。反应液用Fermentas公司的普通PCR试剂盒。扩增条件为：95℃预变性5min；94℃30s，56℃ 30s，72℃45s，35个循环；最后72℃延伸7min。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像观察结果。切下阳性条带，用胶回收试剂盒回收目的片段，用核酸浓度测定仪定量。

2.3.2体外转录

用购自Fermentas生物试剂公司TranscriptAid T7 High Yield Transcription kit进行体外转录，操作步骤按照说明书进行。

2.4RT-PCR扩增

将以上体外转录模板稀释100倍，进行RTPCR扩增：体外转录稀释的模板1μL，RT-PCR Mix 25μL，EBOV2 2μL，EBOV3 2μL，ddH2O 20μL，总体系50μL。扩增程序为：50℃30min；95℃预变性5min；94℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸45s，扩增35个循环；最后72℃延伸7min。结果用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，RTPCR产物胶回收后进行浓度测定。

2.5焦磷酸单链模板制备

根据Gene Company Limited公司的焦磷酸测序反应操作说明制备测序单链模板。将45μL RTPCR单链模板分别加入到PSQ 96板的孔中，并加入测序引物，在85℃的烘箱中放置2min，取出冷却后就可进行焦磷酸测序。

2.6焦磷酸测序反应

将放有样品的PSQ96孔板80℃孵育2 min，冷却至室温后进行焦磷酸测序反应。将酶混合物、底物混合物和四类核苷酸（A、T、C和G）分别加入试剂舱固定位置。设定程序，将试剂舱和PSQ96孔板放入PSQ TM 96 MD System仪器中中进行测序反应。根据PSQTM 96MA System仪器的软件说明在试剂舱中分别加入的底物APS、dNTP和 酶混合物（DNA聚合酶、荧光素酶、ATP硫酸化酶和三磷酸腺苷双磷酸酶）；然后将试剂舱和PSQ 96板放入，进行焦磷酸测序（pyrosequencing）反应。

2.7敏感性试验

以体外转录产物为模板，用优化好的RT-PCR反应条件进行扩增，取5μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，并进行浓度测定。将RT-PCR产物进行2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、128倍、256倍稀释后，进行焦磷酸测序反应，确定试验的敏感性。

2.8重复性试验

将扩增的RT-PCR产物分别进行3次焦磷酸测序，比较每次测得的序列结果，确定试验的重复性和稳定性。

3　结果

3.1PCR扩增结果 利用设计引物扩增埃博拉病毒的特异基因片段，扩增出长度为274bp的目的片段（图1）。

图1　苏丹型埃博拉病毒L基因PCR扩增结果

3.2RT-PCR扩增结果

按RT-PCR程序扩增埃博拉病毒核酸基因材料，所设计的扩增引物能扩增出与设计相符的试验结果（294 bp）。将反应体系增加到100 μL 以获得足够量的目的片断。扩增后的PCR产物用DNA纯化回收试剂盒纯化，并送华大基因公司进行Sanger法测序。电泳结果如图2所示。

图2　苏丹型埃博拉病毒L基因RT-PCR扩增结果

3.3焦磷酸测序反应

焦磷酸测序结果按照10（TGAC）碱基顺序加入程序进行焦磷酸测序，可很好测得苏丹型埃博拉病毒L基因的目的片段序列，经NCBI的在线BLAST分析确证为苏丹型埃博拉L基因片段，测序结果完全正确。后经在线BIAST分析发现TGGCAATCAGTTGGACACAl8个碱基的一段序列即可达到对埃博拉病毒的鉴定目的（图3）。

图 3 苏丹型埃博拉病毒L基因焦磷酸测序图谱结果

3.4敏感性鉴定结果

将体外转录产物为模板的RT-PCR产物稀释8个梯度，即2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、128倍、256倍稀释，稀释后进行焦磷酸测序。结果证实本方法的敏感性为102.8EID50，仍然能够成功测出靶序列（图略）。

3.5重复性试验结果

对每个RT-PCR产物进行3次重复性检测，检测的结果均一致，证明该方法有很好的重复性与稳定性。

4　讨论

埃博拉病毒有着感染性极强，致死率极高的特点，致死率可达50%～90%［15］。对人类健康危害很大。世界动物卫生组织已将埃博拉病毒列为对人类危害最严重的病毒之一。尤其当今社会恐怖活动日益增多，不排除用EBOV制作生化武器的可能。因此我们应该高度重视EBOV，着手于早期防控工作［16］。

目前针对类似埃博拉出血热这样的突发性烈性传染性疾病，我们应及早确定病毒传染源，将有利于做出早期诊断，隔离传染源，切断传播途径，阻止疫情进一步迅速扩大。辅助流行病学调查的实验诊断手段将提供更可靠的研究典范。本次研究就是生物信息学分析结合应用先进实验手段的一个例子，它的应用价值在于PSQ 技术是一种比较新颖的技术，（1）它可以专门对预测的突变位点进行检测，避免了全基因测序；（2）本研究以生物信息学研究为基础，结合PSQ 技术，建立了通过核酸多态性特征确定莱斯顿型埃博拉病毒株的快速鉴定方法，对于突发埃博拉事件是很好的快速应急鉴定方法；（3）通过本研究证实上海兽医研究所送检样品为埃博拉阴性，对于流行病学调查提供了有力证据。其它流行性疾病也可以用类似方法追查其传染源，控制疾病传播，对于流行性疾病的控制有很大帮助。

本实验所建立的PCR-焦磷酸测序检测EBOV-S的方法体现了该方法准确性高、重复性 好、自动化程度高、低成本、灵敏度高、高通量等优点，可一次性检测96份样品，有望成为一种快速检测病原的技术。本试验发现，在测序反应中，将测序引物浓度从0.3M调至0.6M时，能得到峰值更高的图形与结果。

焦磷酸测序技术（pyrosequencing）是近年发展起来的一种能够通过对基因序列测序实现检测和确诊的新型检测技术，具有高通量、快速、敏感等特点［17］，其基本原理是设计带有生物素标记的扩增引物，通过PCR反应生成含有生物素标记的目的基因片段，然后制备测序单链模板。将待测单链模板与测序引物杂交结合，放入PSQTM 96MD System中进行测序反应。与普通RT-PCR和real time RT-PCR等检测技术相比，本技术无需将PCR产物电泳及无需送交公司测序以便确诊，从而大大减少了病原确诊时间。焦磷酸测序操作简单方便，可程序化，便于构建标准化操作流程和规范，从而保证试验结果的稳定性和准确性［18］。苏丹型埃博拉病毒焦磷酸测序方法的建立为今后动物疫病检测技术的研究提供了新的思路。

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（责任编辑：胡藕祥）

Establishment of Pyrosequencing Assay for Detection of Sudan Ebola Virus

Zhao Yonggang，Zou Yanli ，Zhang Yongqiang，Wu Xiaodong ，Wang Qinghua，Wang Zhiliang
（China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032）

［Objective］ To establish a new molecular method for simultaneous and rapid detection and confi rmation of Ebola virus by using sequence analysis combined with pyrosequencing technology. ［Methods］ Amplifi cation primers and a sequencing primer were designed according to the published sequences of conserved L gene regions of three Sudan Ebola viruses in GenBank. A gene sequence was synthesized artifi cially， and the target gene were amplifi ed by PCR， to prepare cRNA through in vitro transcription. RT-PCR was developed for conserved regions of the gene， and the RT-PCR products were pysrosequenced.［Results］ The characterized nucleotide segment was obtained by sequence analysis， and then the segment was confi rmed as Sudan Ebola virus. Compared to the Sanger method of Huada， they showed 100% agreement.［Conclusion］ Pyrosequencing technology based on sequence analysis can be used to confi rm Sudan Ebola virus.

Sudan type EBOV virus；sequence comparison；pyrosequencing

S852.65+9.5

A

1005-944X（2015）09-0077-05