Survivin抑制剂YM155联合阿糖胞苷对人白血病K562细胞系的作用及机制

封蔚莹　金晶　洪攀

Survivin抑制剂YM155联合阿糖胞苷对人白血病K562细胞系的作用及机制

封蔚莹金晶洪攀

目的 探讨survivin抑制剂YM155联合阿糖胞苷（Ara-C）对人白血病K562细胞系的增殖抑制和诱导凋亡作用及机制。方法 实验设6组：对照组、YM155单药组、Ara-C单药组、YM155和Ara-C联合组、YM155序贯Ara-C组、Ara-C序贯YM155组，分别作用于K562细胞。以CCK法检测增殖抑制率，流式细胞仪检测细胞凋亡，western blot法检测凋亡相关蛋白表达。结果 CCK-8法显示YM155和Ara-C单药均能抑制K562细胞生长，YM155序贯Ara-C组细胞增殖抑制率和凋亡率高于其他给药方式组。YM155序贯Ara-C组survivin、Mcl-1蛋白表达显著下降。结论 YM155序贯Ara-C联合能显著抑制K562细胞增殖，可能通过下调survivin、 Mcl-1蛋白诱导K562细胞凋亡。

survivin YM155 阿糖胞苷 K562细胞

慢性粒细胞白血病（CML）是一种恶性血液病，CML加速急变期后使用常规联合化疗效果不理想。近来国内外开展了Ara-C等药物联合作用于CML急变期细胞的体外研究，均显示有一定疗效［1，2］。作者自2012年6月至2014年6月通过实验研究，探讨新型小分子survivin抑制剂YM155联合Ara-C对CML细胞系K562的协同效应和可能机制。

1　材料和方法

1.1药物、试剂 YM155（美国Selleck Chemicals公司），Ara-C（美国法玛西亚公司），RPMI1640培养液及胎牛血清（美国Sigma公司），AnnexinV PI试剂盒（碧云天生物技术研究所），CCK-8试剂盒（上海前尘生物科技有限公司），Survivin 和Mcl-1兔抗人多克隆抗体（美国Cell Signaling公司），HRP标记羊抗兔IgG（英国GE公司），兔抗人B-actin多克隆抗体及HRP标记羊抗鼠IgG（美国Sigma公司）。

1.2细胞系及培养 CML急变期K562细胞系（中国科学院上海细胞生物学研究所），于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，在37℃、5%CO2、饱和湿度孵育箱内培养，2～3 d传代1次，台盼蓝拒染法测定细胞活力，取对数生长期细胞用于实验。

1.3细胞增殖抑制实验 分别以YM155（0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0nmol/L）和Ara-C（2，4，8，16，32，64μg/ml）单药治疗K562细胞48 h和72h，采用CCK-8活性检测试剂盒，操作按照说明书，以酶标仪检测A450处吸光度，以A450（作用组-空白组）/（正常组-空白组）×100%的值为细胞存活率，1-细胞存活率为增殖抑制率。Calcusyn药效学软件计算药物IC50值。

1.4联合和序贯用药的增殖抑制实验 按照前述实验得出的药物IC50值选择YM155（1.0nmol/L）与Ara-C（4.0μg/ml），实验设6组：空白对照组、YM155单药组（Y组）、Ara-C单药组（A组）、YM155和Ara-C联合组（Y+A组）、YM155预处理12h序贯Ara-C组（Y→A组）、Ara-C预处理12h序贯YM155组（A→Y组），分别作用于K562细胞48h。以CCK-8法检测增殖抑制率，得出最佳结果。

1.5流式细胞仪凋亡检测 仍以上述6组作用于K562细胞，操作按照Annexin FITC-PI试剂盒说明书，以流式细胞仪检测细胞凋亡率，Annexin 阳性为早期+晚期凋亡细胞［3，4］，比较各组细胞凋亡情况。

1.6Western blotting 检测凋亡相关蛋白 设4组：对照组、YM155组、Ara-C组、最佳联合作用组。作用于K562细胞0h、12h、24h、36h，收集细胞并裂解提取蛋白于-80℃保存，按照既往方法电泳、转膜、一抗及二抗孵育并ECL显影，扫描成像并进行灰度值差异分析［5］。

1.7统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料用（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1YM155与Ara-C单药对K562细胞增殖的影响 CCK-8法检测结果显示，YM155单药对K562细胞48h、72h的IC50值分别为3.5nmol/L和1.2mmol/L，上述浓度Ara-C单药在48h未达半数抑制浓度，其72h的IC50值为 3.5μg/ml，呈浓度和时间依赖，抑制K562细胞增殖。见图1。

图1　YM155与Ara-C单药分别对K562细胞增殖抑制作用

2.2YM155与Ara-C联合和序贯方法对K562细胞增殖和凋亡的影响 联合作用48h后CCK-8法检测结果显示，两药物联合作用的增殖抑制率均强于单药组及对照组，其中以YM155序贯Ara-C组的增殖抑制率最强，见图2。流式细胞凋亡检测结果显示，两药物联合作用48h的诱导凋亡率均强于单药组及对照组，其中以YM155序贯Ara-C组的凋亡率最高。见图3。

2.3联合作用机制研究 设对照组，YM155组Ara-C组，YM155序贯Ara-C组。对4组凋亡相关蛋白的检测结果显示，YM155单药作用于K562细胞后survivin及Mcl-1蛋白表达均下降，Ara-C单药作用于K562细胞后 survivin蛋白表达轻度升高，Mcl-1蛋白表达下降，YM155序 贯Ara-C组survivin及Mcl-1蛋白表达均显著下降，见图4。

图2　YM155和Ara-C单药或联合、序贯治疗对K562细胞增殖抑制的影响

图3　YM155和Ara-C单药或联合、序贯方法对K562细胞凋亡的影响

图4　不同药物组对K562细胞survivin 和Mcl-1蛋白表达情况

3　讨论

Survivin是耶鲁大学Altier实验室在1997年发现的凋亡抑制因子，具有抑制肿瘤细胞凋亡及诱导耐药性产生等作用，研究认为survivin高表达与CML疾病进展及耐药密切相关［6］，故survivin是研发CML晚期患者新治疗药物的理想靶点。作者前期研究证实survivin反义寡核苷酸能诱导K562细胞凋亡及具有化疗协同效应［7］。YM155是Astellas公司研发的新药，2007年报道该药通过抑制前列腺癌细胞系survivin mRNA及蛋白表达诱导细胞凋亡，属新型survivin抑制剂［8］。此后研究相继发现YM155属细胞周期非特异性药物［9］，与多种抗癌药物联合具有化疗协同作用［10，11］，多中心II期研究证明该药具有良好耐受性，但单药仅部分有效，建议进行多药联合治疗研究［12，13］。Ara-C属作用于细胞周期S期的抗代谢药物，临床上大剂量Ara-C治疗白血病易导致严重骨髓抑制、肺部真菌感染等并发症，导致其临床应用受限，故有学者开展小剂量Ara-C与其他化疗药物的联合应用研究。但小剂量Ara-C可通过诱导细胞survivin表达增加而使体内产生获得性Ara-C耐药的白血病细胞群［14］，故理论分析将survivin抑制剂与小剂量Ara-C联用，以达到降低Ara-C毒性又增加药效的目的。

目前国内外尚无YM155在CML的机制及联合治疗研究。K562细胞系高表达survivin的人CML急变期细胞系，是体外研究抗CML急变药物的良好细胞模型。本资料显示YM155单药下调K562细胞系survivin蛋白表达，抑制K562细胞生长并诱导凋亡；而YM155序贯细胞周期特异性药物Ara-C联合治疗，抑制K562细胞增殖和诱导凋亡的作用显著高于其他治疗组，且该序贯治疗显著下调survivin及Mcl-1 蛋白表达。作者发现YM155可通过激活caspase-8下调survivin来诱导急性髓系白血病细胞凋亡［5］，据报道YM155亦可诱导肿瘤细胞自噬［15］，故未来亦可从细胞周期、caspase凋亡通路及自噬等多方面进行机制研究，YM155序贯Ara-C有可能是从多环节多靶点诱导K562细胞凋亡发挥作用。

通过科学的方法评价YM155和Ara-C各种联合用药方式及疗效，为寻找更有效经济的CML急变患者的联合治疗方案提供理论依据及开辟新思路。结合YM155具有低毒性及可与多药联合治疗发挥协同效应的特点，推测其在未来CML急变患者的临床治疗中可能具有良好的应用前景。

1Li Y， Deng Z， Zhu J， et al. Homoharringtonine combined with cytarabine to treat chronic myelogenous leukemia in myeloid blast crisis and its impact on bone marrow CD34+CD7+ cells. Acta Haematol，2014， 132（2）：172～176.

2陆世丰，陆勤.硼替佐米与阿糖胞苷联用对K562细胞增殖和凋亡的影响. 中华血液学杂志，2010，31（1）：42～45.

3封蔚莹，周炀，钟永根，等.SN-38对K56Z细胞的增殖抑制、凋亡诱导及其与塞来昔布联合化疗的协同作用.华中科技大学学报（医学版），2012，41（2）：156～160.

4封蔚莹，宋春娇，张志坚，等.喜树碱衍生物SN-38对人白血病细胞系HL-60增殖及凋亡作用的实验研究.中华中医药学刊，2014，32（6）：1406～1408.

5Feng W， Yoshida A， Ueda T. YM155 induces caspase-8 dependent apoptosis through downregulation of survivin and Mcl-1 in human leukemia cells. Biochem Biophys Res Commun， 2013， 435（1）： 52～57. 6Reis FR， Vasconcelos FC， Pereira DL，et al.Survivin and P-glycoprotein are associated and highly expressed in late phase chronic myeloid leukemia. Oncol Rep， 2011， 26（2）：471～478.

7封蔚莹， 周炀， 周国忠.survivin反义寡核苷酸诱导K562细胞凋亡及化疗协同作用研究. 临床血液学杂志， 2012， 25（7）： 454～456.

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9Yamanaka K， Nakahara T， Yamauchi T， et al. Antitumor Activity of YM155， a Selective Small-Molecule Survivin Suppressant， Alone and in Combination with Docetaxel in Human Malignant Melanoma Models. Clin Cancer Res， 2011，17（16）：5423～5431.

10Park DG. Antichemosensitizing effect of resveratrol in cotreatment with oxaliplatin in HCT116 colon cancer cell. Ann Surg Treat Res，2014，86（2）：68～75.

11Kaneko N， Mitsuoka K， Amino N， et al.Combination of YM155，a survivin suppressant， with bendamustine and rituximab： a new combination therapy to treat relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma. Clin Cancer Res，2014， 20（7）：1814～1822.

12Kelly RJ， Thomas A， Rajan A， et al. A phase I/II study of sepantronium bromide（YM155， survivin suppressor） with paclitaxel and carboplatin in patients with advanced non-small-cell lung cancer. Ann Oncol，2013， 24（10）：2601～2606.

13Cheson BD， Bartlett NL， Vose JM， et al. A phase II study of the survivin suppressant YM155 in patients with refractory diffuse large B-cell lymphoma. Cancer，2012， 118（12）：3128～3134.

14丁倩，张祥忠，钟雪云，等.阿糖胞苷对白血病细胞K562凋亡抑制基因Survivin的作用研究. 白血病·淋巴瘤，2009，18（5）： 264～273.

15Wang YF，Zhang W，HE KF， et al. Induction of autophagy-dependent cell death by the survivin suppressant YM155 in salivary adenoid cystic carcinoma. Apoptosis，2014，19（4）：748～758.

Objective To investigate the combination effect of the survivin inhibitor YM155 and Ara-C on the proliferation and apoptosis of human leukemia cell line K562 and to explore its mechanism. Methods The K562 cells were divided into 6 groups： control group，YM155 group，Ara-C group，combination group，YM155 following Ara-C group，Ara-C following YM155 group. The cell growth inhibitory rate was measured by CCK-8 assay. The fl ow cytometry was performed to assess cell apoptosis. The apoptosis associated proteins were analyzed by Western blotting. Results The CCK-8 Methods showed that YM155 and Ara-C alone inhibited the proliferation of K562 cells. The growth inhibitory and apoptosis rates in YM155 following Ara-C group were higher than other groups. The protein expression levels of survivin and Mcl-1 decreased remarkably in K562 cells treated with YM155 following Ara-C. Conclusion The combination with YM155 following Ara-C group on K562 cells has synergistic effect. The mechanism may be related with induing apoptosis through down-regulation survivin，Mcl-1.

Survivin YM155 Cytarabine K562 cells

浙江省中医药科技计划项目No.2012ZB159；绍兴市公益性应用计划项目No.2012B70066

312000浙江省绍兴市人民医院