桂枝芍药知母汤对CIA大鼠外周血TNF-α IL-17和IL-10的影响

王芝芩

桂枝芍药知母汤对CIA大鼠外周血TNF-α IL-17和IL-10的影响

王芝芩

目的 观察桂枝芍药知母汤对类风湿关节炎大鼠的作用，探讨类风湿关节炎的发病机制及桂枝芍药知母汤的作用机制，为临床应用提供理论基础。方法 应用牛Ⅱ型胶原蛋白，建立胶原诱导性关节炎（CIA）大鼠模型。应用酶联免疫吸附试验方法（ELISA）检测正常对照组、CIA模型组、醋酸泼尼松组和桂枝芍药知母汤组大鼠血液TNF -α、IL-17和IL-10的浓度。用桂枝芍药知母汤治疗CIA大鼠，观察治疗过程中大鼠关节肿胀程度及关节炎指数。结果 ELISA检测结果显示，CIA大鼠模型组血清TNF-α、IL-17含量明显升高，而IL-10的含量明显下降；桂枝芍药知母汤组TNF-α、IL-17浓度下降，使之趋向正常，而IL-10的浓度上升，同时大鼠关节肿胀程度减轻，关节炎指数下降。结论 桂枝芍药知母汤可通过下调CIA大鼠外周血TNF-α、IL-17水平，上调CIA大鼠外周血IL-10水平，调节其免疫状态，以达到治疗CIA的作用。

桂枝芍药知母汤 胶原诱导性关节炎 TNF-α IL-17 IL-10

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以侵蚀性、对称性多关节炎为主要表现的慢性、全身性自身免疫性疾病。基本病理改变是滑膜炎、血管翳形成。免疫紊乱是RA的主要发病机制。TNF-α、IL-17是RA发生炎症时主要致炎因子，而IL-10是其主要抑炎因子，致炎因子（TNF-α、IL-17）与抑炎因子（IL-10）表达失衡，可能在CIA发病过程中具有重要作用。通过抑制TNF-α、IL-17活性，提高IL-10活性，以达到免疫平衡，有助于控制RA病情进展［1］。作者自2014年5月至12月以桂枝芍药知母汤对胶原诱导性关节炎（collagen - inducing arthritis，CIA）大鼠外周血TNF-α、IL-17和IL-10的影响进行了实验研究。报道如下。

1　材料与方法

1.1实验动物 健康雌性Wistar大鼠60只，体重（110±10）g，SPF级，由浙江中医药大学动物实验中心提供。

1.2实验材料 桂枝芍药知母汤（桂枝、知母、防风各12g，白芍9g，甘草、麻黄、炮附子各6g，生姜、白术各10g）由本院制剂室煎药完成。牛Ⅱ型胶原（Chondrex公司）；不完全弗氏佐剂（Chondrex公司）；冰醋酸（杭州化学试剂有限公司）；检测大鼠TNF-α、IL-17、IL-10 的ELISA试剂盒（上海森雄科技实业有限公司）。

1.3模型建立与分组 在无菌条件下，将冰醋酸（0.1mol/L）于冰浴中充分溶解牛Ⅱ型胶原（bovine collagen type Ⅱ，BCⅡ），浓度为4mg/ml，放置4℃冰箱过夜后，与弗氏不完全佐剂（incomplete Freund's adjuvant，IFA）等体积混合、振荡乳化，制成BCⅡ乳剂，浓度为2mg/ml，放置于4℃冰箱中保存备用。参照文献［2］的造模方法，对造模组大鼠尾根部进行皮内注射以致初次免疫，总量0.5ml。正常组注射0.5ml生理盐水。于初次免疫2周后进行二次免疫，总量0.3ml，方法同前。60只Wistar大鼠随机选取10只为正常对照组（正常组），对其余50只大鼠进行CIA模型建立（其中20只大鼠造模不成功）。选取造模成功大鼠30只，随机分为3组：模型组10只、醋酸泼尼松组10只（泼尼松组），桂枝芍药知母汤组10只（中药组）。

1.4模型成功判定标准 致炎前，以足趾容积测量仪对每只大鼠左后足足趾容积进行测量，作为致炎前足趾基础容积。每周评分关节炎指数（arthritis index，AI）。于首次注射BCⅡ乳剂21d后，根据关节炎指数（arthritis index，AI）评分来评判模型成功［3］。

1.5给药方法 给药时间于造模成功后开始，泼尼松组予醋酸泼尼松5.0mg/（kg·d）的剂量标准灌胃，中药组大鼠予桂枝芍药知母汤22.9g/（kg·d）的剂量标准灌胃，正常组、模型组灌胃等量生理盐水，均1次/ d；连续给药30d。

1.6外周血采集 眼眶取血2ml，静置2h，以3000r/ min离心5min，取上清液作为外周血检测标本，于-20℃冰箱保存备用。

1.7观测指标 （1）足趾肿胀度：采用足趾容积测量仪测量各组大鼠左后足足趾容积，观察足趾肿胀度。测量位置：以无毛区为标记线，即测量标记线以下的足趾容积（ml）；测量时间：第21天（造模成功）、第35天（造模成功后2周）、第49天（造模成功后4周），记录数据。（2）外周血TNF -α、IL-17、IL-10水平检测：采用EL ISA法测定，具体操作按试剂盒说明书要求进行。

1.8统计学方法 采用SPSS 18.0统计软件。计量资料以（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用配对t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组大鼠足趾肿胀度比较 与正常组比较，模型组、泼尼松组、中药组大鼠足趾肿胀明显，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，泼尼松组、中药组大鼠足趾肿胀度明显减轻，差异有统计学意义（P＜0.01）；与治疗前比较，泼尼松组、中药组大鼠足趾肿胀度均明显减轻，差异有统计学意义（P＜0.01），见表1。

表1　各组大鼠足趾肿胀度比较（±s）

表1　各组大鼠足趾肿胀度比较（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.01；与治疗前比较，△P＜0.01

组别n治疗前治疗后中药组104.545±0.347*2.280±0.785*#△泼尼松组104.536±0.255*2.154±0.753*#△模型组104.786±0.713*4.920±0.879*正常组101.260±0.5501.252±0.884

2.2各组大鼠外周血TNF-α、IL-17、IL-10水平比较 与正常组比较，模型组大鼠外周血TNF-α、IL-17水平显著升高，IL-10水平下降，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，泼尼松组和中药组外周血TNF-α、IL-17水平显著性降低，IL-10水平上升，差异有统计学意义（P＜0.01），见表2。

表2　各组大鼠外周血TNF-α、IL-17和IL-10水平比较（±s）

表2　各组大鼠外周血TNF-α、IL-17和IL-10水平比较（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.01

组别nTNF-α（pg/ml）IL-17（pg/ml）IL-10（pg/ml）中药组1012.68±2.37#13.49±0.16#9.49±0.27#泼尼松组1013.18±1.43#12.18±2.45#10.18±2.35#模型组1023.18±2.21*30.42±0.62*5.09±0.65*正常组104.49±0.855.27±0.755.19±0.81

3　讨论

RA属于中医痹证范畴。桂枝芍药知母汤原方出自《金匮要略·中风历节病脉证治》，该方是治疗RA的常用方剂，具有祛风寒除湿、温阳通痹等作用。现代研究表明，桂枝芍药知母汤具有较强的消炎镇痛和免疫调节作用［4，5］。

Ⅱ型胶原诱导关节炎模型是 TrenthamDE等于1977年创立［6］。由于其在主要组织相容性复合物、关节局部病变、性别、collagen Ⅱ（C Ⅱ）自身免疫等方面与RA有较多相似之处，所以CIA模型是目前比较公认的RA动物模型［7］。在实验中，造模后第21天，造模组大鼠关节肿胀明显，通过足趾容积评估及AI评分测量后，提示CIA模型制备成功。

在RA病理过程中，细胞因子异常产生及其相互作用在RA病程中起着非常重要的作用。这些细胞因子根据其性质可分为两大类，即促炎细胞因子和抑炎细胞因子。在正常情况下，促炎因子和抑炎因子处于一个平衡状态，如有外界因素打破这种平衡，则会引发关节炎症。大量研究表明RA发病中Th1细胞起重要作用，Th1主要分泌TNF-α、IL-2、IFN-γ，其中TNF-α是RA炎症过程中主要的破坏性细胞因子，可促进破骨细胞的溶骨作用，从而造成关节畸形；另外，TNF-α对创伤局部血管也有激活和损伤作用，可造成血管内皮细胞在形态和功能上发生变化，增高其通透性，从而加重局部组织炎性细胞浸润和炎性水肿。IL-17主要由活化的T细胞产生，具有强大的致炎作用能刺激成纤维细胞分泌IL-6、IL-8、GM-CSF等炎症因子，抑制软骨细胞合成基质，增强破骨细胞活性，与TNF-α协同参与骨侵蚀。而IL-10是重要抗炎Th2型细胞因子，主要通过抑制核因子KB进而抑制Thl细胞产生TNF-α、IL-2、IFN-γ；可下调抗原递呈细胞功能，抑制基质金属蛋白酶生成，抑制IL-17等致炎因子的功能和生成，从而抑制RA关节炎炎症，控制或阻止软骨及骨的破坏。

本实验结果表明，CIA大鼠外周血TNF-α、IL-17表达水平升高，抑炎因子IL-10表达显著受抑；并且增高的TNF-α和IL-17与炎症指数呈正相关，而降低的IL-10水平与炎症指数呈负相关。给予桂枝芍药知母汤干预治疗后，TNF-α、IL-17表达水平下降，而IL-10表达水平上升，说明桂枝芍药知母汤能减少TNF-α、IL-17的生成，增加IL-10的生成，从而抑制炎性细胞的浸润，减少关节炎的发生和逆转疾病的发展。这可能是桂枝芍药知母汤治疗CIA的作用机制之一，其治疗CIA的其他机制尚需进一步深入研究。

1 宋光，裘红梅.胶原性关节炎大鼠血清中TNF-α、IL-17及IL-10水平分析.大连医科大学学报，2012，34（5）：492～494.

2 沃格尔HG，沃格尔WH.药理学实验指南-新药发现和药理学评价.北京：科学出版社，2001.577～589.

3 Carter RA，Campbell IK，O’Donnell K，et al.Vascular cell adhesion molecule-1（VCAM-1）blockade in collagen-induced arthritis reduces joint in vlovement and alters B cell trafficking.Clin Exp Immunol，2002，128（1）：44～51.

4 徐春元.桂枝芍药知母汤联合云克治疗类风湿性关节炎活动期的临床观察. 湖南中医药大学学报，2013，33（8）：19～20.

5 陈剑梅，金实.金实教授运用桂枝芍药知母汤治疗活动期类风湿关节炎经验.中华中医药杂志，2012，27（12）：3138～3140.

6 Feng H，Yamaki K，Takano H，et al.Suppression of Thl and Th2 immune responses in mice by sinomenine an alkaloid extracted from the Chinese medicinal plant Sinomenium acutum.Planta Medica，2006，72（15）：1383～1388.

7 Chie O，Yoriaki K，Yoji M，et al.Resistance to collagen-induced arthritis in SHPS-1 mutant mice.Biochem Biophys Res Commun，2008，371（3）：561～566.

Objective To explore the effect of Guizhishaoyaozhimu Tang on TNF-α，IL-17 and IL-10 in the rats of collagen - inducing arthritis（CIA）. Methods The cow Ⅱ type collagen was applied forthe establishment of collagen induced arthritis（collagen - induced arthritis and the CIA）model in rats. Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）was used to detect observation of normal control group，model group，the CIA prednisone acetate group and cassia twig peony rhizoma anemarrhenae decoction group rats blood TNF alpha，IL-17 and the concentration of IL-10. The CIA rats treated with Guizhishaoyaozhimu Tang，treatment process index such as joint swelling degree and arthritis were observed and recorded. Results The ELISA test results show that the CIA model group rats serum TNF alpha，IL-17 levels increased signifi cantly，while the content of IL-10 drops obviously；in Guizhishaoyaozhimu Tang group， the level of TNF alpha andIL - 17 concentration decreased，making it tend to norm，while the rise in the concentration of IL - 10，joint swelling of rats were alleviated at the same time，the arthritis index fell. Conclusion Guizhishaoyaozhimu Tang can decrease the level of TNF alpha，IL-17and increase the levels of IL - 10 in CIA rat peripheral blood，adjust the immune status，therefore t for the treatment of the CIA.

Guizhishaoyaozhimu Tang CIA TNF-α IL-17 IL-10

310053浙江中医药大学（在职研究生）

311501 浙江省桐庐县第一人民医院