自体CIK细胞治疗对老年非小细胞肺癌患者循环肿瘤细胞EMT的影响

丁军利　刘超英　许隽颖

自体CIK细胞治疗对老年非小细胞肺癌患者循环肿瘤细胞EMT的影响

丁军利刘超英许隽颖

目的 探讨自体细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）细胞治疗对老年非小细胞肺癌患者循环肿瘤细胞上皮间质转化（EMT）的影响。方法 应用免疫磁珠分选循环肿瘤细胞；实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测EMT标记物CK19、E-cadherin、Vimentin、Snail在CIK治疗前后的表达变化，分析其与临床病理特征的关系，比较CIK治疗前后患者卡氏行为状态（KPS）评分的变化。结果 40例肺癌患者中，上皮细胞标志物CK19、E-cadherin的mRNA阳性表达率分别是90%（36/40）和17.5%（7/40），间质细胞标记物Vimentin、Snail的mRNA阳性表达率分别是60%（24/40）和62.5%（25/40）。CK19、Vimentin、Snail的阳性表达率与性别无关（P＞0.05），与肿瘤的大小、病理分型、分期、淋巴结转移、血行转移明显相关（P＜0.05）。E-cadherin的阳性表达率极低，与临床病理特征均无相关性。CIK治疗后CK19、E-cadherin、Vimentin、Snail的mRNA阳性表达率均显著下降，分别为62.5%（25/40）、0%（0/40）、20%（8/40）、10%（4/40），而且CIK治疗后患者KPS评分显著提高（P＜0.05）。结论 老年肺癌患者循环肿瘤细胞存在EMT，并与肿瘤进展正相关，自体CIK细胞治疗抑制了EMT，并提高了患者的生活质量。

细胞因子诱导的杀伤细胞 老年非小细胞肺癌 循环肿瘤细胞 上皮间质转化

非小细胞肺癌占肺癌的80%左右，30%患者可行手术治疗，约70%～80%的患者发现时已属中晚期［1］。细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killer cells，CIK）具有溶瘤谱广、溶瘤活性高等优点，故CIK在肿瘤的生物治疗领域中极具应用价值［2］。本科自2014年4月至2015年6月开展自体CIK治疗老年肺癌40例获得良好效果，报道如下。

1　临床资料

1.1一般资料 观察组：40例老年肺癌患者均经病理检查证实，男30例，女10例；年龄65～80岁，中位年龄70岁。其中腺癌30例、鳞癌10例。按TNM国际分期法：Ⅲ期10例、Ⅳ期30例。40例患者均有可测量肿瘤病灶；Karnofsky评分＞60分，预计生存期＞3个月；治疗前患者心、肝、肾功能及血常规无明显异常；采血前1个月及治疗期间均未接受过放、化疗。行CIK治疗前签署治疗知情同意书。对照组：10例本院体检健康人（志愿者），男6例，女4例，年龄60～75岁，中位年龄68岁。

1.2方法 （1）血样处理：采集40例肿瘤患者和10例健康志愿者的外周血10ml，使用EDTA管室温保存，于4h内处理。将血样与10倍体积的溶血素混合，冰上孵育15min，12000r/min离心5min，弃上清液，PBS洗涤2次，制成细胞悬液。（2）循环肿瘤细胞（CTCs）的免疫磁性标记、富集和分选：将Fc受体阻断剂（100μl）和单克隆EpCAM抗体偶联的磁性微珠（100μl）先后加入样本的细胞悬液中，混匀，4～8℃孵育30min，然后按操作说明将细胞悬液流经置于磁场中的MS分选柱进行EpCAM阳性细胞分选。由于分选出的EpCAM阳性细胞数量有限，为避免冻存后细胞损失，将分选后的EpCAM阳性细胞立刻进行RNA的提取和检测。（3）实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）：采用RT-PCR法检测通过MACS富集的CTCs相关基因表达。按说明书应用Trizo1试剂盒（Invitrogen公司）提取样本RNA，逆转录试剂盒、扩增试剂盒均购于大连宝生物工程公司。所用的引物均由大连宝生物公司设计并合成。反应条件：95℃30s，95℃5s，55℃30s，72℃30s 40个循环。（4）CIK细胞的制备及回输：血细胞分离机采集患者外周血单个核细胞（PBMC），经淋巴分离液梯度离心（2000r/min，20min），取白膜层的单个核细胞，0.9%生理盐水洗涤3次。将细胞置于IFN-γ1000U/ml无血清培养基，37℃、5% CO2中培养。24h后加入抗CD3单抗100ng/ml，人重组IL-2 1000U/ml，隔日换维持液培养8～10d，按4×109/次回输患者体内。培养和回输过程参照卫生部2003年3月颁布的“人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原则”。（5）CIK治疗前后临床症状及毒副反应观察：主要观察CIK细胞回输过程中患者有无发热、皮疹、恶心、呕吐等不良毒副反应，并且给予相应的对症处理；治疗后14d观察临床症状改善情况，细胞治疗前、治疗后2周行卡氏行为状态（KPS）评分。

1.3统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。计量资料以（±s）表示，采用配对t检验，计数资料采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1EMT标志物在CTC中的表达及与临床病理特征的关系 在10例健康对照组样本中未检测出CK19、E-cadherin、Vimentin、Snail的表达，在40例肺癌患者中，上皮细胞标志物CK19、E-cadherin的mRNA阳性表达率分别是90%（36/40）和17.5%（7/40），间质细胞标记物Vimentin、Snail的mRNA阳性表达率分别是60%（24/40）和62.5%（25/40）。CK19的阳性表达率与性别无关（P＞0.05），与肿瘤的大小、病理分型、淋巴结转移、血行转移明显相关（P＜0.05），而E-cadherin的阳性表达率极低，与临床病理特征均无相关性。Vimentin、Snail的表达与性别无关（P＞0.05），而与肿瘤的大小、病理分型、病理分期、淋巴结转移、血行转移均明显相关（P＜0.05）。

2.2CIK治疗对CTC的EMT的影响 40例肺癌患者，接受CIK治疗后再次检测CTC细胞中CK19、E-cadherin、Vimentin、Snail 的mRNA的表达变化。结果见表1。

表1　CIK治疗前后CTC细胞中EMT标志物表达变化（%）

2.3CIK治疗对KPS评分的影响及毒副反应的观察 CIK治疗前KPS评分80分15例、70分17例、60分8例。CIK治疗后KPS评分80分20例、70分15例，60分5例。患者治疗KPS评分高于治疗前，差异有统计学意义（P＜0.05），表明患者生活质量提高。3例患者回输过程中出现低热（＜38℃），多数患者均无明显不适。

3　讨论

肺癌属于老年性疾病，＞50%晚期肺癌患者的发病年龄＞65岁，由于老年生理性功能退化与伴随疾病的存在，使老年肺癌患者对化疗的耐受性下降，不良反应增加，老年非小细胞肺癌的治疗倍受重视。CIK治疗作为细胞免疫治疗的一部分，具有高效低毒的特殊作用，为老年肺癌患者的治疗提供了新的思路和方向。研究显示CIK治疗改善了肺癌患者的免疫功能，提高疾病控制率和生活质量［3］，但具体机制不详。

CTCs是肿瘤从原发病灶或转移灶脱落进入血液循环的恶性细胞。其形成是肿瘤的进展和远处转移的首要因素［4］。研究显示，上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）赋予了上皮型肿瘤细胞更强的转移和侵袭能力，参与了肿瘤异质性的形成和转移过程［5］。研究表明人类原发性肿瘤中存在EMT，循环肿瘤细胞中同样存在EMT［6］。现已确定的EMT标志物包括E-cadherin、Vimentin、Snail、Twist等。近年，CTCs在肿瘤进展中的作用受到广泛关注。研究显示肺癌患者周围血中存在CTC，对预测化疗疗效和预后判断具有重要价值［7］。而CTC导致最终的转移，EMT在其中发挥了重要作用。EMT使CTC间质化，侵袭和转移能力增强。然而，有关EMT、CTC和临床病理特征之间的关系尚不明确，CIK治疗是否通过抑制CTC发生EMT从而抑制肿瘤复发及转移亦未明确。

本资料结果显示10例健康对照组样本中均未检测出CK19、E-cadherin、Vimentin、Snail的表达，而40例肺癌患者中，CTC上皮细胞标记物CK19、E-cadherin的mRNA阳性表达率分别是90%、17.5%，间质细胞标记物Vimentin、Snail的mRNA阳性表达率分别是60%、62.5%，提示CTC存在EMT现象。CK19作为上皮组织来源的组织特异性标记物，是文献报道中检测微转移应用最多的基因标记［8］，结果显示CK19的阳性表达率最高，提示其作为上皮标记物灵敏度高。E-cadherin主要位于上皮细胞的紧密连接处，E-cadherin表达的减少和缺失可引起细胞间粘连的改变，细胞移动性增加，导致肿瘤的侵袭和转移［9］。检测到E-cadherin mRNA的阳性表达率仅为17.5%，提示CTC在较大程度上失去了上皮细胞的特性。间质细胞标记物Vimentin、Snail的mRNA的阳性表达率较高，提示CTC获得了间质细胞的特性：侵袭和移动性增强［10］。以上结果显示CK19作为微转移及CTC细胞特质，具有灵敏性、特异性高特点，而E-cadherin、Vimentin、Snail对判断CTC的转化特征具有重要意义。

本资料结果亦显示，CK19、Vimentin、Snail的mRNA阳性表达率与性别无关（P＞0.05），与肿瘤的大小、病理分型、淋巴结转移、血行转移明显相关（P＜0.05）。而E-cadherin的阳性表达率偏低，与临床病理特征均无相关性。CK19、Vimentin、Snail的阳性表达多出现在肿瘤＞3cm、腺癌、淋巴结转移、血行转移的肺癌患者。以上结果显示联合检测CTC中CK19、Vimentin、Snail的mRNA表达可以预测患者的预后。

目前，CIK抑制肿瘤进展的机制多集中在免疫功能研究［11］，是否影响CTC中EMT还未见报道。结果显示CIK治疗后CK19、E-cadherin、Vimentin、SnailmRNA阳性表达率分别为62.5%（25/40）、0%（0/40）、20%（8/40）、10%（4/40），均较CIK治疗前明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。提示CIK可能通过抑制CTC的EMT从而抑制肿瘤的进展。另外，CIK治疗后患者的KPS评分显著提高，改善了老年晚期肺癌患者的生活质量。

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11 Thanendrarajan S，Nowak M，Abken H，et al.Combining cytokineinduced killer cells with vaccination in cancer immunotherapy： more than one plus one？ Leuk Res，2011，35（9）：1136～1142.

Objective To investigate the effect of CIK on the epithelial- mesenchymal transition （EMT）of circulating tumor cells in elderly patients with non-small cell lung cancer. Methods Immunomagnetic separation technique has been applied toisolate CTCs. The EMT markers mRNA expression has been identifi ed by Real-time RT-PCR. The relationship between the expressions of EMT markers and clinicopathological features were analyzed. The KPS scores were also detected before and after CIK cell therapy. Result s The positivity rate of EMT markers is 90% （36/40，CK19），17.5% （7/40，E-cadherin），60 %（24/40，Vimentin），and 62.5% （24/40，Snail）respectively； There was signifi cant correlation between the expression of CK19，Vimentin and Snail mRNA expressions with the tumor size，lymph node metastasis，venous invasion，pathological type and clinical staging （P＜0.05）； CIK therapy signifi cantly decreased the mRNA positivity rate（CK19，62.5%； E-cadherin，0%； Vimentin，20%，Snail，10%），furthermore，CIK therapy improved the KPS scores of the patients （P＜0.05）. Conclusions EMT occurred in the CTC of elderly patients with non-small cell lung cancer and it may promote development of the disease； CIK therapies signifi cantly prevent the process of EMT.

CIK Elderly patients with non-small cell lung cancer Circulating tumor cells Epithelial-mesenchymal transition

江苏省自然科学基金（BK2012099）

214023 南京医科大学附属无锡市人民医院肿瘤科