ATP生物发光法检测细菌药敏技术的建立及应用

吴　潇　施　宏★ 陈铮铮

ATP生物发光法检测细菌药敏技术的建立及应用

吴潇施宏★ 陈铮铮

目的 采用三磷酸腺苷（ATP）-生物发光法建立一种快速检测细菌抗生素药敏的技术体系。方法 将金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌两种菌稀释成不同浓度后，分别加入96孔微孔板中，再加入相应的抗生素，并设立空白对照，混匀后放入细菌培养箱中进行培养，不同时间段取出后采用ATP生物发光仪进行检测，计算其发光率判断细菌是否为耐药与敏感。结果 通过优化条件，确定细菌浓度为5×105cfu/ ml，加入抗生素培养生长4h时为检测最佳时间。与纸片扩散法鉴定的结果进行比较，其匹配率达98.5%，两者差异无统计学意义（P＞0.05）；该方法具有良好的重复性，批内、批间CV均＜10%。结论 ATP生物发光法比现有方法缩短＞1d的时间，且操作简便，快速、准确，成本低，可以广泛用于临床标本检测。

三磷酸腺苷 生物发光技术 细菌药敏

我国是世界上滥用抗生素最为严重的国家之一，随着抗菌药物的广泛应用，细菌耐药性日趋严重和普遍，尤其是医院感染的耐药菌株［1］。耐药菌引起的医院感染人数，已占到住院感染患者总人数的30%左右［2］。造成抗生素滥用的很重要的一个原因是微生物检验力量薄弱和用药不合理。细菌三磷酸腺苷（Adenosine Triphosphate，ATP）生物发光法作为一种不断完善成熟的微生物快速检测方法，已经被越来越多地应用于微生物检测［3］。本资料采用ATP生物发光原理，测定平板细菌对抗生素的敏感性，为临床合理选择抗生素提供参考依据。

1　材料与方法

1.1仪器与试剂 主要试剂：萤火虫荧光素酶（FL）、D-荧光素（Ln）：Promega公司。M-H肉汤：杭州天和微生物试剂有限公司。ATP检测试剂、ATP检测裂解液：沈阳中科靓马生物工程有限公司。抗生素来源：中国食品药品检定研究院（中检院）。仪器：Centro LB960 XS3微孔板式发光检测仪：德国Berthold。菌株：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌等菌株由本院微生物科室提供。

1.2实验方法 （1）细菌生长曲线：挑取2～3个纯菌平板单克隆菌落，采用M-H肉汤培养基将菌液稀释成5×106、5×105、5×104、5×103cfu/ml四种浓度，分别取出100μl加入96孔微孔板中，放入37°细菌培养箱中进行培养，从2h开始检测，观察细菌增长与ATP值的关系，以确立细菌培养的最佳浓度及检测时间。（2）细菌药敏试验：药敏试验参照2013年CLSI抗菌药物敏感性试验执行标准，在96微孔板中按照标准设置抗生素浓度梯度，并加入菌液，每孔最终体积100μl，最终菌浓度5×105cfu/ml，并设置不加抗生素的空白对照菌液，混匀后放入37℃细菌培养箱中进行培养，从2h开始检测，以确立抗生素与细菌作用后的最佳检测时间。（3）细菌ATP检测：将96孔板从培养箱中取出并放入Centro LB960 XS3微孔板式发光检测仪中，将ATP检测试剂、裂解液分别注入该仪器的进样器中，通过进样器首先向检测穴中加入50μl ATP检测裂解液，室温条件下裂解5min；然后向该检测穴中加入100μlATP检测试剂，立刻测量发光值，检测时间为2s；记录相对发光值的数值，计算其发光率［发光率=加入抗生素后发光值/不加抗生素发光值×100%］。其发光率≤50%为敏感，＞50%时则报告为耐药，并与常规药敏试验结果进行比较，药敏质控结果符合美国临床实验室标准化研究所（CLSI）的要求，药敏结果判读严格按照2013年版CLSI标准。

1.3统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

图1　金黄色葡萄球菌浓度与ATP增殖关系图

图2　大肠埃希菌浓度与ATP增殖关系图

图3　环丙沙星作用于金黄色葡萄球菌后的ATP信号值

图4　环丙沙星作用于大肠埃希菌后的ATP信号值

2　结果

2.1细菌增长与ATP信号值关系 细菌接种的浓度、不同种类的细菌等均会影响细菌增殖的速度。图1、2分别为金黄色葡萄球菌与大肠埃希菌的生长曲线图，由于细菌的生长周期存在差别，从图中可以看出，大肠埃希菌较金黄色葡萄球菌ATP信号增长幅度快。随着时间及浓度的增加，其ATP增值幅度越大，当细菌的浓度为5×103cfu/ml、5×104cfu/ml时，其在2～6h内ATP信号值增长幅度小，而当菌浓度达到5×105cfu/ ml时，从3h时起ATP信号值增长幅度增大，菌浓度达5×106cfu/ml时，从2h开始其ATP信号值增长幅度明显增加。这是由于细菌初始培养浓度过低，其相对增殖量少，不利于后期是否对药物敏感的判断。因此，细菌的初始培养浓度不能＜5×105cfu/ml（加入至孔中即5×104cfu/孔），且培养时间不能＜3h。此外，检测抗生素作用于菌液的时间尤为关键，图3、4为环丙沙星抗生素分别作用于金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的结果。一般而言，随着药物浓度的降低，药物对细菌的生长影响减小，其发光率会增加。将药物敏感浓度折点的发光率≤50%判断为敏感，将药物耐药浓度的折点＞50%时则报告为耐药。从图3、4可见加入环丙沙星分别作用于大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌后，2h时药物组ATP信号发光率超过空白对照组的50%，4h时药物组ATP信号发光率低于空白对照组的50%，判断结果则由耐药转为敏感。如图1、2所示，由于短时间内细菌增长慢，空白对照组的ATP信号值本身增加幅度小，因而加入抗生素后的药物组与空白对照组的ATP信号值差别就小，发光率＞50%，易误判为耐药；且随着时间的延长，ATP信号值增长幅度加大，空白对照组与药物敏感组的ATP信号值区别增大，易于结果判读。因此加入抗生素作用后共培养的检测时间不能＜4h。

最终通过优化条件，确定细菌初始培养的浓度为5×105cfu/ml，加入抗生素培养生长4h为检测最佳时间，其误差最小。但是初始细菌浓度亦不能过高，时间不宜过长，否则细菌大量增殖，过快损耗培养基中的营养成分，会使细菌处于一个滞缓期；同时微生物新陈代谢和自溶产生了大量的有毒物质，抑制微生物的生长繁殖，细菌自身受到损伤，细菌ATP反而会下降，同样不利于药敏结果的判断。

2.2细菌耐药结果 共选取130例金黄色葡萄球菌，120例大肠埃希菌。金黄色葡萄球菌选取万古霉素、环丙沙星、青霉素等3种抗生素，大肠埃希菌选取环丙沙星、头孢吡肟、庆大霉素等3种抗生素作药敏试验。将250例菌同时对抗生素作药敏试验，与抗生素加入96孔微孔板中混匀后放入细菌培养箱4h后，利用ATP生物发光法计算其发光率，其结果与纸片扩散法的结果进行比较，见表1。关于ATP生物发光法的重复性，随机抽取其中20株金黄色葡萄球菌样品及大肠埃希菌样品在3次传代返祖培养条件下，于3个工作日重复测定，观察本法结果的变异率。结果显示，在同样试验条件下，几乎无变异，变异率（CV）＜10%，可以认为ATP生物发光法是一种比较稳定的细菌药敏方法。

表1　两种方法测定结果比较（个）

3　讨论

伴随抗菌药物的逐年增加和细菌耐药性、敏感谱的变化，临床医师越来越多地依靠药敏试验指导选择用药。因此，尽早获得药敏试验结果具有重要实用价值。传统药敏试验方法一般均需要过夜培养方能观察结果，耗时长，不利于临床医生的用药。在过去的十几年中，应用分子手段检测耐药基因，以及液相色谱、质谱或两者的联用检测抗生素代谢产物来鉴定细菌的耐药性等取得了巨大进展，但是这些技术对硬件设备要求极高，检测成本高，影响因素较多，使得该检测体系在临床中的应用前景受限。

ATP普遍存在于细菌等微生物细胞内，是微生物新陈代谢的一种能量物质；在一定条件下其含量相当稳定，在所有活菌细胞中的ATP含量大致相同，其所含的细菌等微生物的数量与所含的ATP值存在一定的函数关系［4，5］，因此通过检测ATP值即能得到被测标本所含细菌等微生物含量。目前在定量检测ATP的方法中，以生物发光测定方法最为灵敏［6，7］，基于荧光发光原理，通过检测三磷酸腺苷（ATP）与荧光素-荧光素酶反应的荧光光强来实现ATP的检测。

本资料中所采取的ATP检测技术方法成熟，实验结果准确可靠，操作简便快捷，灵敏度高，线性范围宽，成本低廉，十几秒即可得到结果，且测定结果与传统细菌培养法所得结果相比，相关性＞98%。本资料采用ATP-生物发光法建立的一种快速检测细菌耐药性的技术体系，结果表明，细菌与抗生素短时间作用后，与空白对照相比，对抗生素敏感者其值即受到显著抑制，对抗生素耐药者其值不会受到明显抑制。该方法具有良好的重复性（批内、批间CV均＜10%），可于4h内判读结果，比现有方法提前＞1d，且操作简便，快速、准确，能降低临床无效用药，提高用药准确率，减少抗生素滥用，减少患者痛苦，延缓抗生素耐药发生；且所需仪器简单，成本低，适合临床推广使用。

1 李凡，刘晶星.医学微生物学.北京：人民卫生出版社，2008.63～67.

2 李树钧，施海，冯全新，等.医学与哲学，2010，31（2）：5～8.

3 尹子波，侯玉柱，尹建军，等.ATP 生物发光技术在微生物检测中的应用.食品研究与开发，2012，33（2）：228～232.

4 陆烨，胡国庆，陆龙喜，等. ATP 生物荧光技术快速测定细菌总数的应用研究.中国消毒学杂志， 2013，30（7）：613～618.

5 黄昕，李洁，王志，等.ATP含量与细菌数及血液稀释度的相关性研究.中华医院感染学杂志，2012，22（1）：15～17.

6 舒柏华，赵志耀，徐顺清，等.利用生物发光分析技术快速检测微生物的方法学研究.发光学报，1999，20（1）：77～80.

7 李利霞，伍金娥，常超.ATP生物发光检测技术的建立及应用可行性分析.食品科技，2012，37（1）：275～282.

Objective To establish a technical system for rapid detection of antimicrobial susceptibility determination of bacteria by ATP-bioluminescence method. Methods The Staphylococcus aureus and Escherichia coli two were diluted into different concentrations，and incubationed in growth medium with and without antibiotics for different time in the 96 well microplates，then ATP bioluminescence assay was repeated to evaluate the bacteria response to antibiotics.According to the luminescence ratio，the bacteria was determined into resistant or sensitive . Results By optimizing the conditions， when the bacterial concentration was 5×105cfu/ml and incubationed in growth medium with and without antibiotics for 4H was the best time to detect. Compared with the identifi cation results of the disk diffusion method ，the matching rate of the two methods was 98.5% and there was no statistically signifi cant difference between them（P＞0.05）；the ATP bioluminescence technology had good repeatability，intra、 inter CV were less than 10%. Conclusion This method can shorten 1 days or more time than the the established methods，and the operation is simple，rapid，accurate，low cost，can be widely used in clinical specimens.

ATP Bioluminescence technique Antimicrobial susceptibility

314500 浙江省桐乡市第一人民医院检验科（吴潇 陈铮铮）

310030 杭州市迪安医学检验中心（施宏）