冬虫夏草提取液对大鼠实验性肾脏缺血/再灌注后VEGF及肾功能影响

周　芳　张　梅　李龙珠 刘家军　郭俐宏　李　莉★

冬虫夏草提取液对大鼠实验性肾脏缺血/再灌注后VEGF及肾功能影响

周芳张梅李龙珠 刘家军郭俐宏李莉★

目的 建立大鼠肾缺血/再灌注损伤的动物模型，观察冬虫夏草（CS）提取液对其血管内皮细胞生长因子（VEGF）表达及肾功能的影响。方法 大鼠60只，随机分为缺血/再灌注组、CS A、B组，手术摘除大鼠右肾，夹闭左动脉45min后再灌注45min，反复3次，建立大鼠肾缺血/再灌注损伤的动物模型，另设空白对照对照组（n=15），术后CS A、B组采用CS提取液灌胃治疗21d，缺血/再灌注组、对照组灌等量生理盐水。观察各组动物治疗期间活动能力并计算病死率，采用EUSA法测定治疗前后大鼠肾脏组织VEGF及VEGF mRNA表达、血清白介素-8（IL-8）、肌酐（SCr）、胱抑素C（Cys C）及尿素氮（BUN）水平。结果 CS A、B组病死率明显低于缺血再灌注组，肾脏组织VEGF及VEGF mRNA表达均上调，血清IL-8、SCr、Cys C 及BUN明显下降，与缺血/再灌注组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），A、B两组间各指标无显著性差异（P＞0.05）。结论 CS可以上调肾缺血/再灌注损伤模型大鼠VEGF，促进血管新生及肾功能恢复，减轻肾脏血管内皮炎症反应，清除血清Cys C、Cr、BUN进而改善肾功能，对大鼠实验性肾缺血/再灌注损伤有保护作用。

冬虫夏草提取液 肾缺血/再灌注损伤 血管内皮细胞生长因子 白介素-8 肾功能

冬虫夏草（Cordyceps sinensis，CS）为生长在西藏的野生独特物种麦角菌科真菌寄生于蝙蝠娥科昆虫幼虫的子座及幼虫尸体的复合体［1］，具有止血、改善心肌缺血、增强免疫力保护肾脏等功能［2］。其治疗作用机制是提高机体免疫力、调节血管内皮细胞生长因子（VEGF）、改善组织细胞内环境及代谢、调控肾脏组织细胞增殖及肾小管细胞外基质合成、减轻多病因造成的肾脏病理改变而改善肾功能［3］，常用于创伤、大手术、药物肾毒及多病因造成的急、慢性肾功能损害［4］。本实验自2014年7月至9月观察CS提取液对肾缺血/再灌注损伤的动物模型大鼠肾脏组织VEGF表达及肾功能的影响，探讨其对VEGF表达与缺血/再灌注后肾功能损害的相互关系，为其临床应用提供实验及理论依据。

1　材料与方法

1.1实验动物 SPF级SD大鼠60只，体重（200±20）g，雌雄不限，由湖北医药学院实验动物中心提供。动物实验房温度18～25 ℃，湿度50%～75%，12h交替光照，分笼饲养，自由饮水，普通饲料喂养，每日观察动物进食情况，称体重，及时清理粪便。

1.2药品试剂及仪器 天然CS（湖北医药学院附属太和医院药房提供），CS提取液提取方法：CS按文献［5］5g加50 ml/L乙醇浸泡72 h，过滤、蒸去乙醇加3%聚山梨酯配制5g/L的CS提取液备用。水合氯醛（青岛沙子口化工厂）；胱抑素C测定试剂盒（美国RND公司）； ichem-340型全自动生化分析仪（深圳市库贝尔生物科技有限公司，型号：ichem-340）；VEGF试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），提取mRNA试剂及反转录试剂（美国Invitrogen公司）。

1.3模型制备 参照文献［6］将大鼠随机分为对照组、缺血/再灌注组（模型组）、CS A、B组四组，每组各15只。要求术前均禁食12h，不禁饮。麻醉时采用10%水合氯醛（0.28 ml/100g）腹腔注射，腹部向上固定于小动物固定器，自胸骨下缘正中打开腹腔，仔细分离腹主动脉两侧肾动脉，缺血/再灌注组、CS组A、B三组先摘除右肾，然后用小动脉夹夹闭左侧肾肾蒂（肾动、静脉同时夹闭45min致左肾呈暗红色）后松开动脉夹恢复左肾供血，反复夹闭松开3次即可造成急性肾缺血/再灌注损伤动物模型。造模成功后分层缝合腹膜、腹壁肌肉及皮肤。对照组开腹并分离左右侧肾肾蒂，但不摘除右肾、不夹闭造模分层缝合腹膜，术后按（1ml/100g）灌生理盐水；CS A组按（0.1 g/100g）灌胃，CS B组按（0.2 g/100g）灌胃；缺血/再灌注组按（1ml/100g）生理盐水灌胃；以上各组均连续灌胃治疗21d（1次/d）。术后每日碘伏消毒，头孢派酮0.2g/（kg·d）肌肉注射。

1.4检测指标和方法 参照文献［7］，经眶静脉取血1ml，置于-30℃低温冰箱保存以备检测IL-8、SCr、Cys C及BUN，检测时采用ichem-340型全自动生化分析仪测定IL-8、SCr、Cys C及BUN。测试速度：纯生化测试恒速400T/H。测试方法：终点法、两点法（固定时间法）、动力学法（速率法）。测试波长：300～800nm。处死动物取肾脏组织捣碎研磨以备VEGF蛋白分析。检测时5000r/min离心30min，严格按SP试剂盒说明操作，采用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫组织化学检测治疗前后上清液标本中VEGF蛋白质及mRNA表达。

1.5统计学方法 采用SPSS19.0 统计软件。计量资料以（x±s）表示，组间比较采用t检验，计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1大鼠存活情况观察 对照组大鼠反应敏捷，体毛光泽，饮食良好，无动物死亡。缺血再灌注组大鼠竖毛且杂乱无光泽，对光声音反应迟钝，蜷缩不动，部分大鼠拒绝饮食，死亡8例，病死率54%。CS A、B组大鼠活动及饮食比对照组稍差，50%大鼠体毛无光泽，但所有动物均能正常饮食及饮水，A、B组大鼠各死亡2例，病死率26%，存活率达74%，病死率明显底于缺血再灌注组。

2.2CS提取液对肾缺血/再灌注操作模型大鼠SCr、Cys C、BUN及IL-8的影响 见表1。

表1　CS提取液对肾缺血/再灌注操作模型大鼠肾功能SCr、Cys、BUN 及IL-8的影响（±s）

表1　CS提取液对肾缺血/再灌注操作模型大鼠肾功能SCr、Cys、BUN 及IL-8的影响（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与治疗前比较，▲P＜0.05

组别给药时间IL-8（pg/ml）SCr（μmol/L）Cys C（mg/L）BUN（mmol/L）模型组治疗前0.90±0.16171.24±14.062.37±0.2711.62±1.04治疗21d0.93±0.19 *169.6±11.09*2.97±0.29*13.89±1.07* CS A组治疗前0.89±0.14 173.37±9.072.53±0.25 12.62±1.06治疗21d0.41土0.10*#▲134.29±10.08*#▲1.50±0.16*#▲7.02±0.79*#▲CS B组治疗前0.91±0.17 170.07±15.072.53±0.26 13.60±1.23治疗21d0.39±0.09*#▲129.93±11.08*#▲1.47±0.12*#▲6.97±0.67*#▲治疗前0.27±0.08110. 45±9.071.47±0.155.64±0.38治疗21d0.26±0.07109.41±9.081.51±0.205.59±0.37对照组

2.3CS提取液对大鼠VEGF、VEGFmRNA表达的影响 见表2。

表2　CS提取液对大鼠VEGF、VEGFmRNA表达的影响［n=15，（±s）］

表2　CS提取液对大鼠VEGF、VEGFmRNA表达的影响［n=15，（±s）］

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与治疗前比较，▲P＜0.05

组别VEGF（pg/ml）VEGFmRNA治疗前治疗21d治疗前治疗21d模型组14.71±2.2315.94±2.30 *▲2.82±0.183.70±0.18*c CS A组15.96±2.1720.57±3.15*#▲2.87±0.194.98±0.39*#▲CS B组14.61±2.4521.42±3.42*#▲2.85±0.175.14±0.42*#▲对照组8.67±1.197.63±1.121.59±0.171.57±0.16

3　讨论

肾脏缺血/再灌注常造成急性肾损伤（acute kidney injury，AKI），临床发病多由大手术、创伤、造影剂、药物肾毒等［8］多病因引起肾脏组织急性缺血缺氧，肾小球滤过率急骤降低，Cys C、Cr、BUN等代谢物不能及时排出体外，最终导致急性肾功能损伤。近年来CS等中药在控制急性肾损伤的症状及延缓病情发展方面有重要突破。CS主要化学成分有多种微量元素、氨基酸、虫草多糖、有机酸、核苷、肽类及甾醇类等，虫草多糖（CordycepsPolysaccharide，CP）具有药理活性，现代临床应用证实有保护肝肾、抗炎、免疫调节、改善肾功能及减轻肾脏病理改变等作用［9］。

VEGF结构和功能与原发现的血管通透性因子（vascularpennea-bilityfactor，VPF）一致，故称为VEGF/VPF［10］。其是一种高度特异性的促血管生长因子，具有促进多种血管活性物质合成、血管内皮细胞增殖迁移及再生、参与冠状动脉侧支循环形成的调节［11］，故VEGF在临床上常作为血管内皮功能的重要指标之一。IL-8是组织细胞炎症介质，而Cys C、Cr、BUN等可反映肾脏缺血/再灌注后肾功能，故本资料以VEGF的分泌及IL-8及Cys C、Cr、BUN等指标来观察分析CS提取液对大鼠肾脏缺血/再灌注的影响。

本实验结果显示，经21d治疗后，CS A、B组大鼠活动及饮食比对照组稍差，50%大鼠体毛无光泽，但所有动物均能正常饮食及饮水，A、B组大鼠各死亡2例，存活率达74%，说明CS提取液可提高存活率。IL-8及Cys C、Cr、BUN较缺血/再灌注组明显降低，VEGF、VEGFmRNA表达明显上调。分析认为：CS提取液可清除肾脏缺血/再灌注时自由基生成，抑制脂质过氧化反应及肾脏组织横纹肌溶解，增加肾血流量及肾小球滤过率，改善微循环，降低肾小管对Cys C 、Cr、BUN的重吸收，大量清除Cys C、Cr、BUN进而改善肾功能。机体重要炎症介质有IL-8、IL-6等，可在机体感染及其他无菌性炎症反应时诱导激活T、B淋巴细胞分化，增加中性粒细胞溶酶体酶的活性及T、B淋巴细胞、单核巨噬细胞的吞噬功能。本实验在治疗后IL-8降低，提示CS通过下调IL-8，降低T、B淋巴细胞分化，干预炎症细胞及单核巨噬细胞过多进入肾脏组织，阻断IL-8介导激活单核巨噬细胞活化及炎性浸润，避免炎症反应出现局部组织粘连、纤维化造成肾脏缺血/再灌注造成急性肾损伤的发生与发展。大鼠VEGF、VEGFmRNA在表达上调证实CS提取液可以促进VEGF分泌，使缺血/再灌注肾脏侧支循环建立，缺血肾脏组织血管内皮的分化及新生增多，由此达到改善肾脏缺血环境，降低缺血/再灌注对肾小球基底膜的损伤，抑制缺血/再灌注造成肾间质病变、纠正氨基酸、蛋白质及脂质代谢、延缓肾功能减退，增强肾小球对Cys C、Cr、BUN等有害代谢物的滤过，使肾功能最终恢复到正常水平。

1 Palevsky PM，Zhang JH，O’Connor TZ，et al.Intensity of renal support in itically ill patients with acute kidney injury.N Engl J Med， 2008，359（6）：7～9 .

2 张伟，夏晓红，王燕凌，等.老年大鼠肾缺血再灌注损伤一氧化氮合酶的变化与意义 陕西医学杂志， 2011，39（4）：421.

3 丁晨光，田普训，靳占奎，等.冬虫夏草制剂在肾移植受者中的临床应用和机制探讨. 中西医结合杂志，2009，29（l1）：975～977.

4 宋艳丽，郭俐宏，朱克刚，等.百令胶囊对大鼠急性肾缺血再灌注损伤的保护作用.陕西医学杂志，2014，43（1）：25～27 .

5 李辉锋，夏祖生.贝那普利联合百令胶囊治疗慢性肾炎临床观察.当代医学 2011，17（29）：135～135.

6 李霞，李著华，邹平，等.肾上腺髓质素在大鼠肾缺血再灌注损伤中的作用研究.中国现代医学杂志，2003，13（6）： 4～7.

7 Ozmen S， Ayhan S， Demir Y， et al. Impact of gradual blood flow increase on ischemia-reperfusion injury in the rat cremaster microcirculationmodel. J Plast Reconstr Aesthet Surg，2008，61（8）：939～948.

8 张涛志，刘东伟.还原型谷胱甘肽治疗急性肾损伤12例.中国药业，2012，21（5）：67～69.

9 唐瑭，陈德森，郭俐宏，等.冬虫夏草对糖尿病模型大鼠肾脏的保护作用， 2013， 35（6）：510～512.

10 孙熘瑛，徐鹏霄.血管内皮生长因子的研究和应用进展.解剖科学进展，2003，9（4）：361～363.

11 王骏，励建安，金挺剑，等.心肌缺血日负荷对新西兰大鼠血管内皮生长因子表达的影响.中国康复医学杂志，2005，20（3）：165～167.

Objective To establish the animal model of renal ischemia / reperfusion injury，observe the effect of extract of Cordyceps sinensis growth of VEGF expression and renal function factor on vascular endothelial cells. Method 60 rats，were randomly divided into ischemia / reperfusion group，Cordyceps sinensis group A，B，operation resection of right kidney of rat，clipping the left artery 45min and reperfusion 45min，repeated 3 times method，the establishment of renal ischemia / reperfusion injury in animal models，the control group （n=15）as control group，postoperative A，B use of Cordyceps sinensis extract of Cordyceps sinensis by gavage for 21 days （d），ischemia / reperfusion group，saline group was the control. The ability of animal were observed during treatment and calculate the mortality of activity，determination，expression of rat VEGF and VEGF mRNA before and after treatment of serum interleukin -8 using the method of EUSA （IL-8），creatinine （SCr），Cystatin C （Cys C）and blood urea nitrogen （BUN）level. Results Cordyceps sinensis group A，B mortality was lower than in ischemia reperfusion group，VEGF and VEGF mRNA expression were upregulated，serum SCr，C （Cys C and BUN decreased significantly，compared with the ischemia / reperfusion group （P all＜0.05），the difference was statistically signifi cant，A，B between the two groups showed no signifi cant index signifi cant differences （P＞0.05）. Conclusion Cordyceps sinensis can upregulate VEGF in rat model of renal ischemia / reperfusion injury，and promote recovery of renal function in neonatal and blood vessels，reduce renal vascular endothelial infl ammation reaction，clear of serum Cys C，Cr，BUN and improve renal function，on experimental rat renal ischemia / reperfusion injury protection.

Cordyceps sinensis extract Renal ischemia / reperfusion injury Vascular endothelial growth factor IL-8 Rrenal function

442012 湖北省十堰市中医院（周芳 张梅 李龙珠

刘家军）

442000 湖北省十堰市太和医院针灸科（郭俐宏）

442000 湖北医药学院机能实验室（李莉）