PCI术后高血小板反应与CYP2C19基因多态性关系的分析

胡珺婷　杨向军★

PCI术后高血小板反应与CYP2C19基因多态性关系的分析

胡珺婷杨向军★

目的 观察经皮冠状动脉介入（PCI）术后使用氯吡格雷6个月后其高血小板反应发生率及其与CYP2C19基因多态性的关系。方法 入选2012年6月至9月行PCI治疗的冠心病患者47例，术前顿服氯吡格雷300mg、阿司匹林300mg负荷剂量，术后予维持剂量治疗。检测术后6个月最大血小板聚集率（MPA），直接测序法检测CYP2C19基因多态性。将观察对象分为血小板高反应性（HPR）组和非血小板高反应性（nHPR）组，检测血细胞计数、纤维蛋白原、超敏CRP等及CYP2C19基因多态性与HPR的关系。结果 HPR17例，nHPR 30例。CYP2C19基因表型强代谢者21例，一般代谢者18例，弱代谢者8例。HPR组，EMs6例（35.3%），IMs6例（35.3%），PMs5例（29.4%）；nHPR组，EMs15例（50.0%），IMs12例（40.0%），PMs3例（10.0%）。HPR、nHPR组2μmol/L、5μmol/L ADP诱导MPA比较差异有统计学意义（P＜0.01）。EMs、IMs、PMs组间MPA、HPR比较有增高趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 PCI术后患者中接受氯吡格雷治疗的HPR普遍存在。CYP2C19基因检测相关代谢型与HPR无明确相关性。

氯吡格雷 高血小板反应 基因多态性 冠心病

经皮冠状动脉介入（PCI）已于临床广泛开展，双联抗血小板治疗改善长期预后［1］。氯吡格雷抗血小板效果欠佳，称之为治疗中血小板高反应性（HPR）或氯吡格雷抵抗（CR）［2］。其发生机制尚未阐明，氯吡格雷代谢基因多态性可能是其重要机制之一。研究表明CYP2C19同工酶基因的单核苷酸多态性与氯吡格雷产生不同程度抗血小板水平密切相关［3］。针对CYP2C19基因多态性表达，中长期HPR仍未知。本资料拟探讨PCI术后6个月不同氯吡格雷代谢型与HPR关系，进一步指导合理用药。

1　临床资料

1.1一般资料 选取2012年6月至9月间本院收治的冠心病患者47例，其中男38例，女9例；平均年龄（61.60±11.85）岁。术后定期随访，6个月测定最大血小板聚集率（MPA），根据MPA值分为HPR组（n=17）和非血小板高反应性（nHPR）组（n=30）。纳入标准：（1）年龄＞18周岁。（2）符合冠心病的入选标准，行PCI介入治疗，植入雷帕霉素药物洗脱支架。（3）住院期间观察项目、指标及病史资料记录完整。排除标准：（1）对阿司匹林、氯吡格雷或低分子肝素过敏或不能耐受。（2）近期有活动性出血史，明显肝肾功能、凝血功能异常。（3）心脏瓣膜病、心肌炎、先天性心脏病、感染性心内膜炎患者等。两组年龄、性别、吸烟、合并高血压、糖尿病、高脂血症等组间比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2方法 入选患者PCI术前根据病情予顿服负荷剂量拜阿司匹林300mg、波立维（硫酸氢氯吡格雷）300mg。根据冠状动脉造影确定PCI方案，所有PCI操作均依据现行指南为参照标准。术中、术后是否使用低分子肝素、GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂取决于手术医生的病情判断。术后维持剂量拜阿司匹林100mg，1次/d，波立维75mg，1次/d，双联抗血小板治疗≥1年。PCI术后通过电话、门诊等方式对入选患者随访12个月，记录患者病情变化。术后6个月采血检测CYP2C19 *2、*3 基因多态性，血小板聚集率等。

1.3血小板聚集功能测定 采用比浊法测定血小板聚集率，嘱患者空腹，取静脉血5ml于柠檬酸钠抗凝管中。血标本在2h内完成检验。取柠檬酸钠抗凝血5ml以800r/min离心5min，吸取上层血浆为富血小板血浆（PRP）。将去PRP血浆的剩余全血以3500r/min离心10min，上清液即为贫血小板血浆（PPP）。制备终浓度为2μmol/L、5μmol/L ADP诱导剂。将300μl PPP加入比色杯内，插入比色孔，进行调零。取出比色杯，加入300μl PRP及搅拌子1个，插入比色孔，每个比色杯内各加入2μl的ADP诱导剂。每加1个ADP即按相应序号键开始检验。同理进行5μlADP诱导剂的血小板聚集率测定。血小板聚集反应检测持续5min，报告参数包括60s、120s、180s 血小板聚集率（PA）及MPA。以上检测在普利生血小板聚集仪上进行。

1.4基因分析 空腹用EDTA抗凝管抽取3ml静脉血，采用直接测序法检测CYP2C19 *2、*3 SNP基因多态性，具体步骤包括样本DNA抽提-PCR扩增-PCR扩增子消化（虾碱酶）-测序PCR反应并纯化扩增产物-测序仪检测-分析结果、得出报告。检测人基因组CYP2C19*2和CYP2C19*3，CYP2C19基因型包括：野生型：CYP2C19 *1/*1。突变杂合型：CYP2C19 *1/*2、*1/*3。突变纯合型：CYP2C19 *2/*2、*3/*3、*2/*3。表现型：强代谢者（EMs）：CYP2C19 *1/*1；一般代谢者（IMs）： CYP2C19 *1/*2、*1/*3；弱代谢者（PMs）：CYP2C19 *2/*2、*3/*3、*2/*3。

1.5基线资料收集 所有观察对象均记录：（1）基本信息如性别、年龄、体重指数等；既往病史如糖尿病、高血压病等。（2）实验室常规检查项目如白细胞计数、血红蛋白、血小板计数、胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、血肌酐、尿素氮、纤维蛋白原、超敏C反应蛋白、左室射血分数（LVEF）值等。（3）PCI手术情况如病变血管、处理血管、药物涂层支架（DES）植入类型、数量、TIMI分级等临床资料。

1.6统计学分析 采用SPSS 17.0 统计软件。计量资料以（x±s）表示，组间均数比较采用独立样本t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析（ANOVA）。计数资料以%表示，采用χ2检验或Fisher精确检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1冠状动脉造影情况及PCI治疗特征 入选观察对象均行PCI治疗，冠状动脉造影显示病变血管、处理血管及植入支架数目、长度、直径等指标，结果显示HPR组植入DES长度、直径、数量均高于nHPR组，但两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1　接受PCI治疗患者手术情况（±s）

表1　接受PCI治疗患者手术情况（±s）

变量HPR组（n=17）nHPR组（n=30）DES长度（mm）21.00±4.2918.57±5.65 DES直径（mm）2.89±0.372.86±0.39 DES植入数量（枚）1.24±0.441.17±0.38病变血管（根）1.29±0.591.60±0.77前降支（LAD）［n（%）］14（70.0）17（51.5）左回旋支（LCX）［n（%）］2（10.0）9（27.3）右冠状动脉（RCA）［n（%）］4（20.0）7（21.2）TIMI分级-Ⅲ级［n（%）］13（76.5）26（86.7）

2.2CYP2C19基因多态性 根据纳入观察范围47例的CYP2C19基因多态性检测，CYP2C19野生型（*1/*1）21例，CYP2C19*2纯和突变型（*2/*2）6例，CYP2C19*3纯和突变型（*3/*3）2例，CYP2C19*2杂合突变型（*1/*2）14例，CYP2C19*3杂合突变型（*1/*3）4例。根据是否携带CYP2C19 LOF基因，分组EMs 21例，IMs 18例，PMs 8例。

2.3组间HPR、CYP2C19分布及MPA比较 （1）根据HPR分组：定义HPR为MPA≥46%［4］，发生HPR17例、nHPR30例。HPR组，EMs6例（35.3%），IMs 6例（35.3%），PMs 5例（29.4%）。nHPR组，EMs15例（50.0%），IMs12例（40.0%），PMs3例（10.0%）。HPR组与nHPR组2μmol/LADP诱导MPA为（43.15±9.90）vs（28.43±7.48），5μmol/LADP诱导MPA为（52.92±6.75）vs（35.33±7.00），组间比较差异有统计学意义（P＜0.01）。（2）根据CYP2C19表型分组：比较CYP2C19不同基因表型间MPA，EMs（n=21）、IMs（n=18）、PMs（n=8），以2μmol/ L、5μmol/L ADP诱导MPA分别为（30.53±7.79）vs（34.59±11.23）vs（41.09±14.95），（39.91±9.54）vs（41.97±9.73）vs（46.57±16.14）。HPR发生率分别为28.6%、33.3%、62.5%，P=0.251。随访期间各组均无主要心血管事件（MACE）发生，EMs因冠心病症状再住院2例（9.5%），PMs再住院2例（25.0%），IMs无再住院。组间MPA、HPR发生及再住院率差异均无统计学意义（P＞0.05）。

3　讨论

据统计约有1/3服用氯吡格雷的冠心病患者存在HPR［5］。研究指出在氯吡格雷负荷剂量后发现HPR存在对PCI术后短期、长期预后有一定影响，尤其早期血栓形成［6］。Cuisset等［7］提出在氯吡格雷负荷剂量后，将即刻评价氯吡格雷反应作为长期预后指标之一不可靠。利用血小板功能检测、基因检测对氯吡格雷反应做出评价是有其价值的，但检测必要性、如何检测、何时检测及其有效性等基本问题仍有较大争议。

本资料发现，PCI术后6个月后HPR在EMs、IMs、PMs各组发生有上升趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。分析原因包括：目前绝大多数为围手术期研究，ACS患者围手术期冠状动脉血管壁损伤严重，持续血小板激活、血栓负荷重等因素持续作用，术前氯吡格雷负荷剂量顿服后，吸收至其抗血小板作用完全发挥时间大约6h，加之GPⅡb/Ⅲa受体抑制剂等强化抗血小板药物的应用，前后MPA改变可能较为明显。CYP2C19作为氯吡格雷在体内转化为活性代谢物的重要肝酶代谢基因，虽然CYP2C19野生型理论上无氯吡格雷代谢障碍，但仍可能存在HPR；而携带CYP2C19 LOF突变基因亦有可能达到预期抗血小板水平。本资料CYP2C19突变比例与目前多数研究基本一致，不排除虽为突变型，但因其他CYP同工酶代谢代偿而达到预期抗血小板作用水平。

研究表明CYP2C19 LOF基因突变患者，MACE发生率有所上升［8］。研究［9］表明，CYP2C19 *2的患者在接受75mg氯吡格雷维持量（MD）治疗时，30%存在HPR，但同样基因条件下，接受10mg普拉格雷MD治疗则未出现HPR，提示改变药物种类，使用新型抗血小板药物等临床干预，可能改善预后及转归。ACCF/AHA心肌梗死诊治指南将第三代噻吩吡啶类药物普拉格雷及替格瑞洛作为抗血小板药物Ib类推荐，氯吡格雷则因存在HPR、起效时间较长等问题降为Ic类推荐。

基于抗血小板抗栓治疗在心血管病领域的重要意义，尤其对PCI术后的患者改善长期预后作用，基因检测与血小板功能检测的实际价值亟需更大规模、更深入的研究进一步证实。

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Objective We aimed to investigate the relationship between cytochrome （CYP）2C19 *2，*3 polymorphisms and high ontreatment platelet reactivity （HPR）in patients treated with percutaneous coronary interventions （PCI）and dual antiplatelet therapy over a 6-month period. Methods Totally 47 patients post-PCI were enrolled from June 2012 to September 2012. Patients received a 300mg loading dose（LD）clopidogrel and aspirin before PCI，then continued with maintenance dose（MD）as dual antiplatelet therapy. Max platelet aggregation（MPA）was assessed in post-PCI patients after 6 months. Direct sequence was used to genotype the CYP2C19*2、CYP2C19*3 polymorphisms in these patients. HPR was defi ned as MPA≥46%，whereas those having＜46% were nHPR. According to CYP2C19 polymorphism，we examined MPA and HPR in different phenotype. Results HPR was present in 36.2% patients. The phenotype of CYP2C19 includes EMs 44.7% （n=21），IMs 38.3%（n=18）and PMs 17.0% （n=8）. In HPR group and nHPR group，there were EMs 35.3% （n=6），50.0% （n=15），IMs 35.3% （n=6），40.0% （n=12），PMs 29.4% （n=5），10.0% （n=3），respectively. There’s no statistic differences among EMs、IMs、PMs in MPA and HPR distribution.Conclusion HPR is common in patients received clopidogrel after PCI. There is no substantial interaction between CYP2C19 polymorphism and platelet reactivity on clopidogrel.

Clopidogrel High on-treatment platelet reactivity CYP2C19 Polymorphisms Coronary heart disease