抑制PAR4表达对肠癌细胞SW620药敏性的影响

韩　娜　曹　江★

·论著·

抑制PAR4表达对肠癌细胞SW620药敏性的影响

韩娜曹江★

目的 探讨抑制PAR4表达对肠癌细胞SW620药敏性的影响。方法 采用MTT法测定SW620细胞、空载体转染细胞SW620/ pcDNA3.1（+）和针对人PAR4的人工microRNA表达载体转染细胞SW620-m1、SW620-m2对肠癌临床常用化疗药物5-氟尿嘧啶和顺铂的IC50，分析抑制PAR4的表达对SW620细胞药物敏感性的影响。结果 与SW620和SW620/pcDNA3.1（+）两组对照细胞相比，PAR4表达受抑制的SW620-m1、SW620-m2两组细胞对5-氟尿嘧啶的IC50均显著升高（P＜0.01），对顺铂的IC50亦有明显升高（P＜0.01，P＜0.05）。结论 抑制肠癌SW620细胞PAR4的表达将增加其对5-氟尿嘧啶和顺铂的耐受，提示以PAR4为靶点的肠癌联合药物治疗研究需要综合考虑用药的合理性。

PAR4 表达 抑制 肠癌 药敏

大肠癌是常见的恶性消化道肿瘤之一，化疗是其主要的辅助治疗手段［1，2］。蛋白酶激活受体（PARs）是一类带有7个跨膜区的特殊的G蛋白偶联受体（GPCR），其N末端被特异性蛋白酶裂解后成为自身配体，形成新的N-末端通过与受体本身的细胞外区域结合，激活细胞内的一系列信号传导通路，进而调控下游相应基因的转录表达（Figure 1）。由于包括各种PARs在内的GPCR是较好的药物作用靶点［3，4］，而且目前市场上畅销的靶向治疗药物中约占40%的药物是以各种GPCR为作用靶点［5］，因此以PARs为作用靶点进行药物开发研究具有重大意义。目前已明确PARs有4种，其中PAR4是近来新发现的一个低亲和力的凝血酶受体［6］。本资料在前期实验基础上［7］，分析抑制PAR4表达对肠癌细胞SW620耐药方面的影响。报道如下。

1　材料与方法

1.1材料 人体大肠癌细胞株SW620购自美国菌毒种保管中心（ATCC），由本实验室保存。小牛血清、RPMI1640等（Invitrogen公司），5-氟尿嘧啶（上海旭东海普药业公司），顺铂（齐鲁制药有限公司），G418和MTT（AMRESCO公司产品）。

1.2细胞培养 所有细胞均培养于含10%小牛血清、100U/L青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640培养液中，培养条件为37℃、5%CO2、饱和湿度。

1.3PAR4表达抑制稳定转染细胞的建立 将在前期的研究中构建针对PAR4基因的8个串联连接的人工microRNA（8xPAR4-ami）表达载体转染的SW620细胞［7］，经G418 （800μg/ml）筛选，2周后具有抗性的细胞株形成克隆后，在倒置显微镜下标记，并分别转移至24孔板继续培养，然后转移至6孔板，获得稳定转染pcDNA3.1 （+）-8xPAR4-ami的两株单克隆细胞命名为SW620-m1、SW620-m2。

1.4MTT法测定IC50 取处于对数生长期的细胞，以含10%小牛血清的RPMI1640调整细胞悬液以3×103个/孔的密度接种96孔板中，每种细胞做3个复孔，贴壁后，小心吸弃培养基，加入以10%小牛血清的RPMI1640配制的含5-氟尿嘧啶药物浓度为31.25μg/ ml、15.625μg/ml、7.813μg/ml、3.906μg/ml、1.953μg/ ml、0.977μg/ml、0.488μg/ml、0.244μg/ml、0.122μg/ ml；顺铂的药物浓度为25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ ml、3.125μg/ml、1.563μg/ml、0.781μg/ml、0.391μg/ ml、0.195μg/ml。每个浓度设3个复孔，置于37℃、5%CO2及饱和湿度条件下进行培养3d后，弃去培养基，干燥后用DMSO（200μl/孔）溶解结晶，在570nm处读取吸光度值，计算相对抑制率（%）=（1-ODn/ODo）×100%（本实验ODn即为不同药物浓度下的OD值，ODo为未加化疗药物的OD值），然后计算50%细胞抑制生长所需的药物浓度（IC50）。

1.5统计学方法 采用SPSS16.0统计软件。计量资料以（±s）表示，组间比较采用t检验，计数资料采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1PAR4人工microRNA对SW620细胞中PAR4的表达抑制 提取转染pcDNA3.1（+）- 8xPAR4-microRNA的SW620组、空载体转染组和未转染组细胞的总蛋白，利用Western blot检测其中PAR4表达水平，结果见图1。从图中可以看出转染表达质粒的SW620-m1、SW620-m2细胞株较空载体对照组和阴性对照组有明显的抑制。

图1　Western blot检测各细胞株中PRR4的表达水平

2.2PAR4表达抑制对SW620细胞药敏性的影响 转染细胞组 SW620-m1、SW620-m2、空载组SW620/ pcDNA3.1（+）和对照组细胞SW620分别对顺铂、5-氟尿嘧啶的IC50值，结果显示SW620-m1、SW620-m2与SW620/pcDNA3.1（+）细胞相比对顺铂的IC50有明显差异（P＜0.01，P＜0.05）；SW620-m1、SW620-m2与SW620/pcDNA3.1（+）细胞相比对5-氟尿嘧啶的IC50均有明显差异（P＜0.01），表明PAR4表达抑制能降低SW620细胞对顺铂、5-氟尿嘧啶的敏感性。见表1。

表1　PAR4表达抑制对SW620细胞药敏性的影响（±s）

表1　PAR4表达抑制对SW620细胞药敏性的影响（±s）

注：与 SW620比较，*P＜0.01；与SW620/pcDNA3.1（+）比较，#P＜0.01；

细胞株IC50（μg/ml）5-FuDDP SW6201.79±0.071.47±0.05 SW620/pcDNA3.1（+）1.83±0.151.47±0.02 SW620-m13.55±0.08*#2.46±0.25*# SW620-m23.28±0.03*#2.33±0.27*#

3　讨论

肠癌的发生发展及转移是一个多因素、多步骤影响的复杂过程。多药耐药（multidrug resistance，MDR）是当前治疗肠癌的主要障碍。肠癌MDR的机制异常复杂，只有掌握肠癌耐药的发生机制，才能有效干预耐药的发生，并帮助建立耐药逆转策略。RNA干扰技术在肠癌MDR研究中的应用主要体现在细胞膜糖蛋白MDR1/P-gp、MDR相关蛋白（multidrug resistance associated protein，MRP）及相关酶类、转录因子、细胞凋亡调控基因等中的应用［8，9］。研究发现抑制这些基因表达，能提高肿瘤细胞内药物水平，减少肿瘤药物的排泄，并成功逆转耐药，恢复肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，从而提高化疗药物的疗效［10，11］。同时突变与功能缺失导致肠癌细胞引起化疗诱导凋亡抑制与耐药，p53基因是重要的抑癌基因，目前通过导入野生型p53基因［12］，能抑制细胞内化疗药物的排出，从而提高对化疗药物的敏感性。

随着对蛋白酶功能的深入研究，传统的关于蛋白酶在肿瘤生长、进展和转移中的作用观点发生了巨大的变化。研究发现，某些蛋白酶，如凝血酶可以作为信号分子经由蛋白酶活化受体PARs通过其偶联的G蛋白酶引发一系列信号转导，进而调控相应基因的表达。PAR4是新近发现的凝血酶受体，在不同的组织细胞中，PAR4的表达程度并不相同。PAR4在肠癌细胞的表达是上调的，虽然这一表达水平变化的具体原因及机制尚不明确，提示PAR4在肿瘤细胞中表达的上调可能与肿瘤细胞的各种恶性表型有一定的关系，随着各种以GPCR为靶点的新型药物的出现，靶向PAR4可以作为一种新的个体化治疗手段进行研究。

由于microRNA显示了更好的稳定性与基因沉默效果，作者采用RNA干扰技术，构建了多个发夹结构的PAR4的microRNA的真核表达载体特异性抑制结肠癌细胞PAR4的表达，分析PAR4表达抑制对肠癌细胞药敏性的影响。本资料结果发现与SW620和SW620/pcDNA3.1（+）两组对照细胞相比，PAR4表达受抑制的SW620-m1、SW620-m2两组细胞对5-氟尿嘧啶的IC50均显著升高（P＜0.01），对顺铂的IC50亦有明显升高（P＜0.01，P＜0.05）。表明抑制肠癌SW620细胞PAR4的表达将降低其对5-氟尿嘧啶和顺铂的敏感性。

Gratio V等［13］研究发现PAR4经激活Erc、ErbB-2激酶促进肠癌细胞的增殖，Mize GJ等［14］通过靶向PAR1、PAR2基因小分子干扰RNA抑制前列腺癌细胞DU-145、PC-3和LNCaP的生长，可能与阻断ERK1/2激酶有关。根据本实验结果，推测由于培养3d后，转染重组质粒组的细胞较转染空载组细胞处于S、G2/M期的细胞数少，对化疗药的敏感性降低所致，其具体的机制尚有待于进一步证实。

本资料数据结果提示今后以PAR4为靶点的肠癌联合药物治疗研究需要综合考虑用药的合理性，联合用药时应避开这些药，或找到耐药机制克服耐药后再联合用药。这些结果为全面深入地研究PAR4对肠癌耐药的影响和相关的分子机制打下基础，指导临床采用有效的个体化疗方案。

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Objective To explore the effect of PAR4 inhibition on sensitivity to chemotherapeutic drugs of human colorectal carcinoma SW620 cells. Methods MTT method was used to determine the half-inhibition concentration （IC50）to chemotherapeutic drugs that are commonly used in clinical treatment of colorectal cancer 5-Fu and DDP for human colorectal carcinoma SW620 cells，vector-alone transfected SW620 cells and PAR4-targeting artifi cial microRNA-expressing vector transfected SW620-m1 and SW620-m2 cells. Results Compared with parental cell line SW620 and vector control SW620/pcDNA3.1（+）cells，the SW620-m1 and SW620-m2 cell line with inhibited PAR4 expression exhibited signifi cantly increased IC50 for 5-Fu（P＜0.01）and DDP（P＜0.01，P＜0.05）. Conclusions Inhibition of PAR4 expression in SW620 cells leads to the increase of drug resistance to 5-Fu and cisplatin，which suggests that reasonableness should be considered when conducting investigation on combination of PAR4-targeting therapy with other chemotherapeutic drugs for colorectal cancer treatment.

PAR4 Expression Inhibition Colorectal cancer Drug sensitivity

国家自然科学基金（30271450，30672365）

310022浙江省肿瘤医院化疗中心（韩娜）310009 浙江大学医学院附属第二医院临床研究中心（曹江）*通讯作者