韩丽鑫,吴广彦,藏媛媛,贺秉军
(南开大学 生命科学学院,天津 300071)
拟除虫菊酯是一类人工合成的具有神经毒性的杀虫剂,因其具有高效、低毒、广谱和较好的环境兼容性等优点,被广泛应用于杀灭农业及卫生害虫.拟除虫菊酯按化学结构特点分为2类:Ⅰ型拟除虫菊酯,分子中没有 α-氰基,如七氟菊酯(tefluthrin,TM);Ⅱ型拟除虫菊酯,分子中有1个α-氰基,如溴氰菊酯(deltamethrin,DM)[1].
棉铃虫 Helicoverpaarmigera(Hübner)是对农业危害极大的一种鳞翅目夜蛾科昆虫,其分布及寄主范围非常广泛.在中国,棉铃虫每年给棉花一项经济作物所造成的直接经济损失可高达50亿元.20世纪90年代初,在黄河和长江流域棉区曾发生过棉铃虫特大灾害,造成直接经济损失多达百亿元[2].虽然棉铃虫已对拟除虫菊酯类杀虫剂表现出明显的抗药性[3],但鉴于开发新药的难度与成本巨大,拟除虫菊酯现仍占世界杀虫剂市场份额的20%以上,且所占份额在不断增加[1,4].因此,在没有新的高效安全的杀虫剂问世之前,如何延长拟除虫菊酯的使用寿命有非常重要的现实意义.这就需要先探明拟除虫菊酯的杀虫机理及棉铃虫产生抗药性的原因.
自从发现电压门控钠通道(Voltage-gated sodium channels,VGSCs)不是拟除虫菊酯唯一的作用靶标以来,已有大量有关拟除虫菊酯其他作用靶标的研究报道.如有研究认为,拟除虫菊酯除作用于VGSCs外,还可影响电压门控钙通道(Voltage-gated calcium channels,VGCCs)[5-6]、电压门控氯通道[5,7]、ATPase[7]、钾通道[8]、GABA受体[7,9]等.还有一些研究结果表明,拟除虫菊酯可通过某些机制影响细胞内的Ca2+浓度.Clark等[10-11]研究发现,DM可通过作用于N-型VGCC(Cav2.2)来升高大鼠离体突触内的Ca2+浓度,且该反应与VGSCs无关;Cao等[1]发现包括DM和TM在内的9种拟除虫菊酯都可增加原代培养的鼠神经元内的Ca2+浓度,且该反应引起的Ca2+内流与VGSCs有关;也有报道[12]称蜜蜂脑神经元上的T-型VGCC是拟除虫菊酯的作用靶标.很多实验都已证明拟除虫菊酯可增加胞内的Ca2+浓度水平,但拟除虫菊酯是通过何种机制引起的该反应还没有统一结论[1,10,13-14].
本研究利用激光扫描共聚焦显微镜技术,以棉铃虫神经元为实验材料,探究2种拟除虫菊酯——溴氰菊酯和七氟菊酯对神经细胞内游离Ca2+浓度的影响,并进行了机理初探,以期有助于阐明拟除虫菊酯的杀虫机理.
本实验室所用棉铃虫购自中国农业科学院植物保护研究所,该种群为农药敏感品系,购得的棉铃虫一直在本实验室内人工饲养传代,饲养方法如下:
棉铃虫属变态发育,一个世代要经历虫卵、幼虫、蛹和成虫4个阶段,其中幼虫有5~7个龄期.实验室饲养一个世代的棉铃虫约需28 d.在棉铃虫的不同生长阶段,饲养方法有所不同.棉铃虫虫卵孵化成幼虫后,将其转移至预先放有小块饲料的玻璃皿中,保鲜膜封口,并留有通气孔.幼虫在生长期间,应及时更新饲料.3龄幼虫可用于实验.为避免大龄幼虫之间相互撕咬,保种用幼虫(4龄及以上)转移至6孔细胞培养皿中继续饲养待其化蛹.棉铃虫的蛹放入饲养笼中待其羽化成成虫后交配产卵,期间在笼中放置糖水供成虫食用,并保持周围环境适宜的湿度.饲养笼顶部罩有湿润纱布,雌蛾交配后一般在其上产卵,1~2 d更换1次纱布.换下的纱布放入玻璃缸中,待虫卵孵化进入下一个世代周期.
棉铃虫饲养室内温度一般保持在25~28℃,相对湿度为70%左右,适当通风.光照时间可同外界环境,但幼虫化蛹期间应减少光照.棉铃虫的整个饲养过程都要防止其接触到各类杀虫剂,同时应注意避免致病细菌、病毒等感染虫体,做好培养皿、镊子等工具及养虫室的消毒灭菌工作.
将经过12h饥饿处理的棉铃虫幼虫(3~4龄)浸泡在体积分数为75%的酒精中消毒3次,与此同时幼虫被酒精麻醉.消毒后的幼虫用生理溶液(100 mmol/L的 NaCl,4 mmol/L 的 KCl,2 mmol/L 的 CaCl2,1 mmol/L的 MgCl2,5 mmol/L 的葡萄糖,130 mmol/L 的 D-甘露醇,10 mmol/L 的 Hepes,pH7.0)冲洗体表.将幼虫置于自制解剖盘上,背面朝上.用固定针压住虫体头部的一侧固定.在靠近尾端一侧的体壁上剪一横向切口,再沿虫体纵向剪开其背部体壁,暴露出消化道.环切虫体肛门前体壁,使肛门连同消化道与体壁分离(注意不能剪破消化道,以免肠道细菌污染).将肛门与消化道向前放置,随后立即在虫体腹部的体壁内侧滴加生理溶液,可见有一串黄色呈念珠状排列的腹神经索位于体壁上,将其取出并转移至生理溶液中.解剖针划开每个神经节外周的神经鞘,转移至消化酶液(Ⅰ型胶原酶液:由不含Ca2+、Mg2+的生理溶液和1 mg/mL的Ⅰ型胶原酶配制而成,pH7.0;中性酶液:由不含Ca2+、Mg2+的生理溶液和4 mg/mL的中性蛋白酶配制而成,pH7.0.将这2种酶液1∶1混合,现用现配)中酶解6~7 min.将消化后的神经索转移至细胞培养皿的培养基(0.7mg/mL的葡萄糖,0.4mg/mL的D-果糖,0.06mg/mL的琥珀酸,0.06 mg/mL的咪唑,13.7 mg/mL的L-15 Leibovitz培养基,2.8 mg/mL 的 TC-yeastolate,2.8 mg/mL的水解乳蛋白,2.383 mg/mL的Hepes,体积分数10%~15%的胎牛血清)中,终止酶解,并用细口径的玻璃吹打管吹打神经索,使神经细胞脱落分离.分离的神经细胞置于共聚焦专业培养皿(中央玻片直径15 mm)中,27℃的培养箱中培养,至少培养3h贴壁,用于后续实验.
实验前,用常规倒置显微镜检查细胞状态及其贴壁情况.荧光染料负载时,弃去原培养基,使用荧光测钙含 Ca2+外液(145 mmol/L 的 NaCl,5.8 mmol/L 的KCl,2 mmol/L 的 CaCl2,1 mmol/L 的 MgCl2,5.5 mmol/L 的葡萄糖,10 mmol/L 的 Hepes,10 mmol/L 的蔗糖,pH6.9)漂洗细胞1次.加入5μmol/L的Fluo-3/AM荧光染料溶液(用荧光测钙含Ca2+外液配制,现配现用)100μL,27℃避光孵育30~60 min.负载后,弃去Fluo-3/AM,用荧光测钙含Ca2+外液再次漂洗细胞2~3次.最后,在共聚焦专业皿中加入900μL荧光测钙含Ca2+外液,27℃培养箱中避光孵育20 min以确保染料在细胞内完全去酯化,上机检测.对于细胞外液无Ca2+组,将实验中染料负载结束后漂洗所用的荧光测钙含Ca2+外液及最后加入的900μL外液同时替换成无钙外液(2 mmol/L的CaCl2替换成5 mmol/L的EGTA,同时为保证合适渗透压,不添加蔗糖,其他成分保持不变)即可.对于河豚毒素(tetrodotoxin,TTX,电压门控钠通道阻断剂)干预组,神经细胞负载完荧光染料并用外液漂洗后,加入含有5μmol/L的TTX荧光测钙含Ca2+外液,避光孵育10 min后上机检测.
将负载好的细胞置于激光扫描共聚焦显微镜的载物台上,用显微镜选择贴壁、负载良好且分布相对集中的细胞.设置扫描各项参数:信号采集频率为3 s/幅;扫描时间共10 min.在扫描1~2 min获得神经细胞未受刺激时的荧光基线水平后,加入一定量的DM(Aladdin,分析标准品)或 TM(Sigma,纯度 96.4%),继续实时观测药物施加后的细胞荧光变化情况.实验中所用药物(DM或TM)溶解于二甲基亚砜(DMSO)中,并在实验前用荧光测钙含钙离子/无钙离子外液配制成一定浓度使用.DMSO总体积分数在1‰以内.
所测得的细胞荧光强度反映了胞内的Ca2+浓度水平.细胞荧光强度变化以实时荧光值F与初始荧光值(即加药之前获得的荧光基线)的均值F0的比值(F/F0)来表示.
所得数据应用SPSS 20(IBM)软件进行单因素方差分析(ANOVA),以p<0.05为标准,表示差异具有统计学意义,并用“*”标注.
共聚焦显微镜下,连续动态记录细胞的荧光强度(用F/F0表示)变化即可反映出该细胞内Ca2+浓度的实时变化情况.在记录到细胞的基础荧光水平后,用终浓度为10μmol/L的DM和TM分别刺激棉铃虫的神经细胞,结果如图1所示.当细胞外液中存在Ca2+时,DM或TM分别刺激后,神经细胞的荧光强度明显增加,且升高到一定水平后,基本维持在高水平处,如图1(a)和图1(b)所示;对照组荧光强度无明显变化,如图1(c)所示.
图1 DM和TM刺激下棉铃虫神经细胞内Ca2+的荧光强度(细胞外液中存在Ca2+)Fig.1 Fluorescence intensity of Ca2+in central neuronsofh.arm igera exposed to DM and TM(with Ca2+in extracellular solution)
鉴于细胞内Ca2+的荧光强度波动较大,采用加药后第5分钟内的Ca2+荧光强度的平均水平进行各组数据的比较分析,如图2所示.
图2 DM和TM刺激第5分钟内棉铃虫神经细胞内Ca2+的平均荧光强度(细胞外液中存在Ca2+)Fig.2 Average fluorescence intensity of Ca2+in central neuronsofh.armigera exposed to DM and TM in the fifth Minute(with Ca2+in extracellular solution)
细胞外液中无Ca2+时,用10μmol/L的DM或TM分别刺激棉铃虫神经细胞.共聚焦显微镜下记录到的细胞荧光强度无明显变化,测试时间(10 min)内一直在荧光基线水平上下波动,如图3所示.
图3 DM和TM刺激下棉铃虫神经细胞内Ca2+的荧光强度(细胞外液中不存在Ca2+)Fig.3 Fluorescence intensity of Ca2+in central neuronsofh.armigera exposed to DM and TM(w ithout Ca2+in extracellular solution)
神经细胞用浓度为5μmol/L的TTX孵育10 min后上机检测,结果如图4所示.DM和TM都不能再使棉铃虫神经细胞的荧光强度升高.在测试时间(10 min)内,细胞的荧光强度一直在荧光基线水平上下波动.
采用加药后第5分钟内的Ca2+荧光强度的平均值进行各组数据的比较分析,如图5所示.
图5 TTX孵育后DM和TM刺激第5分钟内棉铃虫神经细胞内Ca2+的平均荧光强度(细胞外液中存在Ca2+)Fig.5 Average fluorescence intensity of Ca2+in central neurons ofh.arm igera exposed to DM and TM in the fifth Minute(incubated with TTX and with Ca2+in extracellular solution)
由图5可以看出,DM和TM都可以刺激棉铃虫神经细胞内的Ca2+浓度升高,但该反应只有在细胞外液中存在Ca2+时才会发生.而当细胞外液中无游离Ca2+存在时,神经细胞内的Ca2+浓度水平在DM或TM刺激前后无明显变化,加药后第5分钟内的胞内平均Ca2+浓度水平与对照组相比,二者之间的差异不具有统计学意义(p>0.05).该结果表明,DM和TM都可以升高胞内Ca2+浓度,但这一反应与胞内钙库无关.用TTX预处理神经细胞后,即使细胞外液中存在游离Ca2+,DM或TM都没有再改变胞内的Ca2+浓度水平.这说明DM或TM对胞内Ca2+浓度的影响很可能与细胞膜上的VGSCs相关.
目前,“VGSCs是拟除虫菊酯的主要作用靶标”这一结论已获得广泛共识[9,15],而随后研究发现的拟除虫菊酯的其他作用靶标,有些可能并不是拟除虫菊酯杀虫的主要原因,但也许有助于增强拟除虫菊酯的毒性[16].目前,已有大量报道称拟除虫菊酯可以影响胞内的Ca2+浓度,但对于拟除虫菊酯通过何种途径影响胞内Ca2+浓度目前仍存在争议[1,10,13-14].
Clark等[10-11]发现DM是通过作用于N-型VGCC(Cav2.2)来升高突触内的Ca2+浓度,且DM对N-型VGCC的这种修饰作用与VGSCs无关.然而Hildebrand等[7]发现丙烯菊酯(allethrin)对在HEK293细胞中异源表达的哺乳动物的 L-型(Cav1.2)、T-型(Cav3.1)和 P/Q-型(Cav2.1)VGCCs有抑制而非激活作用.Neal等[17]发现丙烯菊酯可刺激已分化的PC12细胞的Ca2+电流增加,且该反应不受TTX影响,针对VGCCs的不同亚型丙烯菊酯的作用也不相同,对PC12细胞的N-型VGCC有抑制作用,却可激活L-型VGCC.该结果与DM作用于异源表达在卵母细胞上的Cav2.2得到的结果[13]有所不同.
值得注意的是,上述研究结果多来自于哺乳动物的离体突触体或异源表达系统,它们与体内完整的神经细胞有一定差别,后者有胞内的调节因子调控,同时具有自发活性,不需要外界刺激(如高浓度的K+或电压)激活.为此,Cao等[1]以原代培养的鼠神经元为实验材料,探究11种拟除虫菊酯对胞内Ca2+浓度的影响.结果发现9种拟除虫菊酯(包括DM和TM)可以升高神经元内的Ca2+浓度,且TTX可阻断这9种拟除虫菊酯引起的胞外Ca2+内流,表明Ca2+内流与VGSCs有关,这与Clark等[11]用大鼠脑突触体实验得到的结论完全不同.Wu等[18]研究发现,TM可使大鼠垂体瘤细胞及下丘脑神经细胞上的L-型VGCC电流幅度减小.也有报道称T-型VGCC是拟除虫菊酯的作用靶标[12-13,19].
目前,对拟除虫菊酯是否可以促使胞内钙库释放Ca2+也没有统一结论.在牛玉杰[14]、杨俊[12]和Cao 等[1]的实验中,拟除虫菊酯不能诱导胞内钙库释放Ca2+.但郭朕群等[20]和Hsu等[21]的实验却表明DM可触发钙库释放Ca2+.
本研究中七氟菊酯和溴氰菊酯都可使棉铃虫神经细胞内的Ca2+浓度升高,说明DM和TM可通过某种途径使胞外Ca2+内流和/或胞内钙库释放Ca2+,最终导致胞内Ca2+增加.当细胞外无Ca2+存在时,DM和TM对神经细胞内的Ca2+浓度无影响,表明二者是作用于细胞膜,使外钙内流而非内钙释放,此结果与牛玉杰等[14]、杨俊等[12]用原代神经细胞实验所得结论一致.VGSCs是公认的拟除虫菊酯的作用靶标,作用机制是拟除虫菊酯延长VGSCs的开放时间,使细胞膜持续去极化[15],这让人联想到DM和TM能使胞内Ca2+浓度增加是否与Na+内流有关.本研究发现,VGSCs被TTX阻断后,即使细胞外液中存在Ca2+,DM和TM对神经细胞内Ca2+浓度仍无影响.这个结果与牛玉杰等[14]和Cao等[1]的实验结果相符,但却与Clark等[10-11]和Neal等[17]的结果相悖.这可能是因为实验材料(原代细胞、异源表达系统、离体突触体)的不同会影响拟除虫菊酯的修饰结果,完整的原代神经元具有自发活性,且胞内具有调控因子对其进行调节.类似情况也曾出现在Clark等[10]和Symington等[22]的其他研究中:用 DM分别刺激表达在卵母细胞上的野生型Cav2.2和发生T422E突变(人为引入磷酸化,以模拟DM在体内作用的情况)的Cav2.2得到的结果截然不同,Alves等[23]也证实了这一结论.可见,细胞内的调控因子对拟除虫菊酯的作用影响很大.因此,推测DM和TM很有可能是先作用于棉铃虫神经细胞的VGSCs上,触发Na+内流,使细胞膜持续去极化激活VGCCs,或通过胞内Na+超载激活反式Na+/Ca2+交换体[1],最终导致神经细胞内Ca2+浓度异常升高.这一推测仍需后续实验证实.
本研究利用激光扫描共聚焦显微镜技术,探究了七氟菊酯和溴氰菊酯对棉铃虫神经细胞内Ca2+浓度影响的作用机制,初步得到的实验结果为:2种拟除虫菊酯——七氟菊酯(Ⅰ型)和溴氰菊酯(Ⅱ型)都可升高棉铃虫神经细胞内的Ca2+浓度水平,该反应与胞内钙库无关,很可能是七氟菊酯或溴氰菊酯先作用于电压门控钠离子通道触发Na+内流后引发的反应.
[1]CAO Z,SHAFER T J,MURRAY T F.Mechanisms of pyrethroid insecticide-induced stimulation of calcium influx in neocortical neurons[J].Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics,2010,336(1):197-205.
[2]杨亦桦.棉铃虫对拟除虫菊酯氧化代谢抗性的生化与分子机理[D].南京:南京农业大学,2005.
[3]魏洪义,杜家纬.拟除虫菊酯类杀虫剂对棉铃虫雌蛾化学通讯系统的影响[J].植物保护学报,2006,33(3):298-302.
[4]陶黎明.昆虫抗药性及其治理对策的研究[D].上海:中国科学院上海生命科学研究院,2005.
[5]SODERLUNDDM,CLARK JM,SHEETSL P,et al.Mechanisms of pyrethroid neurotoxicity:implications for cumulative risk assessment[J].Toxicology,2002,171(1):3-59.
[6]SOUNDARARAJANRP.Pesticides-Advancesin Chemicaland Botanical Pesticide[M].Croatia:InTech,2012.
[7]HILDEBRAND ME,MCRORY JE,SNUTCH T P,et al.Mammalian voltage-gated calcium channels are potently blocked by the pyrethroid insecticideallethrin[J].Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics,2003,308(3):805-813.
[8]RAOGV,RAOK SJ.Modulation of K+transport across synaptosomes of rat brain by synthetic pyrethroids[J].Journal of the Neurological Sciences,1997,147(2):127-133.
[9]HOSSAINMM,RICHARDSON JR.Mechanism of pyrethroid pesticideinduced apoptosis:role of calpain and the ER stress pathway[J].Toxicological Sciences,2011,122(2):512-525.
[10]CLARK JM,SYMINGTONSB.Pyrethroid action on calcium channels:neurotoxicological implications[J].Invertebrate Neuroscience,2007,7(1):3-16.
[11]CLARK JM,SYMINGTONSB.Neurotoxic implicationsof theagonistic actionof CS-syndromepyrethroidson theN-typeCav2.2calciumchannel[J].Pest Management Science,2008,64(6):628-638.
[12]杨俊.溴氰菊酯对蜜蜂脑神经细胞内钙离子影响的研究及机理初探[D].北京:中国农业科学院,2012.
[13]SYMINGTON S B,CLARK J M.Action of deltamethrin on N-type(Cav2.2)voltage-sensitive calcium channels in rat brain[J].Pesticide Biochemistry and Physiology,2005,82(1):1-15.
[14]牛玉杰,石年,李龙,等.溴氰菊酯对大鼠神经细胞内游离钙的影响[J].卫生毒理学杂志,2001,15(4):216-218.
[15]NARAHASHI T.Neuronal ion channels as the target sites of insecticides[J].Pharmacology and Toxicology,1996,79(1):1-14.
[16]BRECKENRIDGECB,HOLDEN L,STURGESSN,etal.Evidence for aseparatemechanismoftoxicityfortheTypeⅠand theTypeⅡpyrethroid insecticides[J].Neuro Toxicology,2009,30(Suppl):17-31.
[17]NEAL AP,YUANY,ATCHISONWD.Allethrindifferentially modulates voltage-gated calcium channel subtypes in rat PC12 cells[J].Toxicological Sciences,2010,116(2):604-613.
[18]WUSN,WUYh,CHENBS,et al.Underlyingmechanism of actions of tefluthrin,a pyrethroid insecticide,on voltage-gated ion currents andonaction currentsinpituitary tumor(GH3)cellsand GnRH-secreting(GT1-7)neurons[J].Toxicology,2009,258(1):70-77.
[19]SHAFER T J,MEYERD A.Effects of pyrethroidson voltage-sensitive calcium channels:a critical evaluation of strengths,weaknesses,data needs,and relationship to assessment of cumulative neurotoxicity[J].Toxicology and Applied Pharmacology,2004,196(2):303-318.
[20]郭朕群,贺秉军,高永闯,等.溴氰菊酯对神经细胞钙通道和钙库的激活作用[J].昆虫学报,2000,43(3):248-254.
[21]HSUSS,CHOUCT,LIAOW C,et al.Deltamethrin-induced[Ca2+]i rise and death in HGB human glioblastoma cells[J].Chinese Journal of Physiology,2012,55(4):294-304.
[22]SYMINGTONSB,FRISBIERK,KIMH J,etal.Mutation of threonine 422 toglutamic acid mimicsthephosphorylationstateand alterstheaction of deltamethrin on Cav2.2[J].Pesticide Biochemistry and Physiology,2007,88(3):312-320.
[23]ALVES A M,SYMINGTON SB,LEE Sh,et al.PKC-dependent phosphorylations modify the action of deltamethrin on rat brain N-type(Cav2.2)voltage-sensitive calcium channel[J].Pesticide Biochemistry and Physiology,2010,97(2):101-108.