葛根复方对重症肌无力大鼠IFN-γ和TGF-β1的影响*

杨俊超　文颖娟　王　超

陕西中医药大学(咸阳712046)



·实验研究·

葛根复方对重症肌无力大鼠IFN-γ和TGF-β1的影响*

杨俊超文颖娟△王超

陕西中医药大学(咸阳712046)

目的:研究葛根复方对重症肌无力大鼠干扰素γ(IFN-γ)和 转化生长因子-β1(TGF-β1)影响，并探讨其作用机制。方法:将80只lewis大鼠随机分为4组，造模成功后分别给予阳性对照组(强的松)，葛根复方组连续灌胃治疗4W给予药物治疗。结果:与空白组比较，造模组的IFN-γ表达水平显著升高，与模型组比较，强的松组和中药组大鼠的血清中IFN-γ含量明显降低；治疗后与强的松组比较，中药组IFN-γ含量要偏低与空白组比较，造模组的TGF-β1表达水平显著降低，与模型组比较，强的松组，中药组大鼠的TGF-β1含量明显升高；治疗后与强的松组比较，中药组TGF-β1含量要偏高。结论:葛根复方抑制了IFN-γ的含量，促进俄TGF-β1含量升高。

重症肌无力(MG)发病机制可能与多种因素相关，近来研究发现干扰素γ(IFN-γ)和转化生长因子-β1(TGF-β1) 能干预MG的病理免疫反应过程。本研究人使用人工合成的乙酰胆碱抗体阻断剂复制实验性重症肌无力大鼠模型，并观察葛根复方对重症肌无力大鼠治疗中IFN-γ和TGF-β1表达的影响。

1　材　料

1.1药物葛根复方(葛根20g,黄芪、丹参、苍术、黄柏、牛膝、薏苡仁各15g)药物购自陕西中医学院校医院药房。中药治疗组大鼠药物用量为临床用量的6.25倍。阳性对照组(强的松)用0.2﹪的羧甲基纤维素钠将强的松配置成0.54mg/mL混悬液备用。

1.2动物80只雌性8周大SPF级的Lewis大鼠，体重160～180g,大鼠购买与西安交通大学医学实验动物中心，许可证编号：SCXK(陕)2013-001.质重统计学不存在差异。

1.3试剂与仪器由南京金斯瑞生物科技有限公司合成的鼠源性AchR-α亚基97-116肽段序列(the rat sequence 97-116 of the AchR α subunit,R97-116), 磷酸缓冲液(PBS)，强的松，完全弗氏佐剂(CFA),不完全弗氏佐剂(IFA),0.2﹪的羧甲基纤维素钠, 生理盐水，氨水，乙醇，水合氯醛，液氮，酶联免疫吸附剂测定试剂盒(ELESA), 550型酶标仪(由美国Bio-Rad公司提供)。

2　方　法

2.1造模先将80只大鼠分为正常对照组10只和模型组70只，模型组大鼠四足底垫皮内和腰腹部皮下注射含有100μg肽段的完全弗氏佐剂和PBS的混合乳液200μL。第2次免疫加强在初次免疫30天后进行，第2次注射量为50μg肽段的不完全弗氏佐剂和PBS混合乳液200μL。正常对照组皮下注射等量PBS。

2.2筛选分组从模型组筛选出有明显肌无力症状的大鼠60只，将其随机分成B组(模型对照组)，C组(强的松)，D组(葛根复方组)，每组20只大鼠。

2.3给药选择造模成功的大鼠分组成功后给予药物治疗。大鼠药物给予的剂量相当于成人等效剂量的6.25倍，采用灌胃方式给药(1mL/100g)。给予正常对照组和模型对照组0.9﹪氯化钠溶液灌胃，强的松给药计量为5.4mg/kg/d，葛根复方组给药剂量为11.46g/kg/d。大鼠每日给药一次，连续给药4周。

2.4酶联免疫吸附法检测IFN-γ的表达 采用普遍应用易操作的酶联免疫吸附法，操作步骤：将从腹腔静脉收集好的血液离心放置，采用大鼠IFN-γ试剂盒检测分析，应用双抗体夹心法测定标本中的IFN-γ的表达，用纯化的大鼠干扰素γ抗体包被微孔板制成固态抗体，微孔中依次加入IFN-γ，再与HRP标记的羊抗属抗体结合，形成复合物，彻底洗涤后加入底物TMB显色。酶促反应下呈蓝色，并在酸的作用下终成黄色，颜色的深浅成负相关。酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)。

2.5检测胸腺组织中TGF-β1因子的表达 大鼠深度麻醉后，切割分离取出大鼠胸腺组织，称取重量，加入定量的PBS,PH=7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。解冻后的组织在2-8摄氏温度下，加入匀浆液手工研磨匀浆充分，加入细胞组织消化液，并用200目的筛网过滤掉未碾磨碎的团装组织，用2000～3000转离心20min，收集上清液检测，依照IFN-γ的检测方法，在酶标仪中检测TGF-β1因子的表达情况。

3　结　果

3.1大鼠的体重和肌力的变化在重症肌无力试验中，大鼠的体重的变化和肌力的检测往往作为肌无力模型制造是否成功和药物治疗是否有效的比较直观的观测指标。试验中大鼠的肌无力症状越重体重的增长就越慢，甚至出现了负增长的趋势。为了更具体的评价肌无力症状的轻重，目前比较广泛采用的是Lennon肌力评分方法，lennon把大鼠的肌力评分根据其客观的外在表现分为1,2,3,4级，肌力评价分值也会随着肌无力症状的加重而升高[1]。大鼠的体重和肌力评分结果如下：和空白组大鼠相比，模型组的大鼠体重明显偏低(P<0.01)，和模型组大鼠相比较，强的松治疗组和中药治疗组的体重明显增加(P<0.05)，中药组大鼠和模型组大鼠的体重无明显差异(P>0.05)；和空白组比较，模型组大鼠的肌力评分明显偏高(P<0.01)，和模型组大鼠比较，强的松治疗组和中药治疗组的肌力评分明显降低了(P<0.05)，中药治疗组和强的松治疗组的肌力评分比较，强的松组稍微偏高(P<0.05)。结果表示中药治疗确实有一定效果，见表1。

表1　大鼠的体重变化和肌力评分的对比±s)

注：与空白组比较,△P<0.01；与模型组比较,▲P<0.05；与强的松组比较□P<0.05

3.2 IFN-γ的检测结果 大鼠肌无力模型制造成功后，采取体外静脉取血的方法检测血清中IFN-γ因子的含量水平，并在药物治疗周期结束后，同样静脉采血检测血清中IFN-γ因子的含量，并作治疗前后的含量对比试验，结果显示：治疗前与空白组比较，肌无力模型制造各组大鼠血清中IFN-γ因子的含量水平显著升高(P<0.01)，治疗后与模型组比较，强的松治疗组和中药治疗组中大鼠血清中IFN-γ含量水平显著降低(P<0.05)；治疗后强的松治疗组和中药组中IFN-γ含量比较，差异不明显。结果显示强的松，中药组的治疗都有效果，中药组的治疗效果达到预期效果，并表明在肌无力的发病初期，IFN-γ可以促进肌无力病程加快，其含量OD值和肌无力症状成正比，这说明IFN-γ在肌无力发病过程中有重要的检测意义，可以为肌无力的发病机理的研究提供更多帮助。结果见表2

表2　治疗前后大鼠血清中IFN-γ表达水平比较±s)

注：治疗前与空白组比较,△P<0.01； 治疗后与模型组比较,▲P<0.05

3.3TGF-β1的检测结果 肌无力大鼠造模成功后，随机选取大鼠5只取出胸腺，并研磨成悬液状，离心提取上清液，检测上清液中TGF-β1的表达，治疗周期结束后，处理大鼠取胸腺并制作标本，再次检测上清液中TGF-β1的表达，并治疗前后的比较。结果显示：治疗前和空白组比较，肌无力模型制造各组大鼠胸腺组织中TGF-β1表达水平显著降低(P<0.01)，治疗后与模型组大鼠比较，强的松治疗组和中药治疗组中大鼠胸腺中TGF-β1表达水平明显升高(P<0.01)；治疗后中药治疗组和强的松治疗组比较，中药治疗组中TGF-β1表达水平要偏高(P<0.05.)。

表3　治疗前后大鼠胸腺组织中TGF-β1表达水平的比较(pg/mL ，x±S，)

注：治疗前与空白组比较,△P<0.01； 治疗后与模型组比较,▲P<0.05

4　讨　论

重症肌无力疾病作为一种疑难杂症，目前西医认为是神经阻断，信号传递障碍导致的，故而临床治疗多应用抗碱酯酶药物及免疫抑制剂，这些药物或多或少会带来些副作用，如瞳孔缩小，多口水，出汗，腹痛，腹泻等，而且患者会产生药物的长期依赖性，对机体的长期伤害难以估计，所以许多医者试图从中医“痿证”的角度出发探讨其机理，并试图找到缓解治疗的办法，并且近些年来已经取得了值得肯定的成果。本实验从中医脏腑学说为出发点，认为发病的部位肌肉多和脾有关，脾主四肢肌肉，脾主运化和全身气机的化生，并且脾脏和相应的免疫器官主宰者机体免疫功能，所以认为主肌无力主要因为脾肺虚弱，生化乏源，脾虚失运，气虚下陷，水湿阻滞，蕴而生热，同时可能夹杂卫外不固，而外感风寒湿之邪，最终导致邪实正虚，气血运行不畅，湿热困阻于肌肉筋膜，出现虚实夹杂的症状，针对这种病机，本实验拟葛根复方试从输肌驱邪，益气健脾，清热利湿的角度出发来治疗肌无力病证。方药选择葛根，黄芪，丹参，苍术，黄柏，牛膝，薏苡仁来配伍，方中葛根既可以输肌以驱邪，清热利水，输肌以通络；黄芪补脾肺之气，益气实卫；丹参可以清热以活血，凉血祛瘀；再合四妙，燥湿清热，利水活血，疏通经络，引湿热从下焦而去，牛膝并可强健筋骨，舒筋缓急[2-3]。全方攻补兼施，益气健脾，清热利湿，活血祛瘀，治疗脾肺气虚，湿热内阻进而拟提高机体免疫力，达到驱邪强体的效果，实验结果证明对肌无力症状起到了一定的疗效。

本课题探讨了重症肌无力的发病机理，认为免疫功能的失调可能是其中一种发病原因，继而从中医的角度探讨相关脾主肌肉四肢的理论学说，采取了补消并施的治疗方法来益气健脾，清热祛湿，已达到驱邪扶正的治疗目的，最终取得了值得认可的效果。

[1] Lennon VA, Griesmann GA, McCormick DJ, et al.Definition of myasthenogenic Sites of the Human acetylcholine Receptor Using Synthetic Peptides [J], Ann NY Acad Sci, 1987, 505:439-450.

[2] 龙志刚,廖小平,文国强,等.神经免疫性疾病TGF-β1与糖皮质激素的关系[J].中国误诊学杂志,2000,2(2):168-169.

[3] 文颖娟，周永学，王江.基于“线粒体-肌肉-脾”探讨脾胃失调与重症肌无力发病的关系[J].现代中药，2013,33(5):25-28.

(收稿2015-03-16；修回2015-04-30)

R746.1

Adoi:10.3969/j.issn.1000-7369.2015.09.084

*国家自然科学基金项目(81202642)

陕西省重点学科建设项目(2013JK0823)

主题词 重症肌无力 葛根复方 干扰素γ 转化生长因子-β1