丹皮酚对二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌前病变的预防作用*

宋艺君　杨史军　王　湘　张东星　冯丽莉　孙　燕　蔡大勇　王玥琦△

陕西中医药大学药学院(咸阳712046)



丹皮酚对二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌前病变的预防作用*

宋艺君▲杨史军□王湘▲张东星▲冯丽莉▲孙燕▲蔡大勇□王玥琦△▲

陕西中医药大学药学院(咸阳712046)

目的：研究丹皮酚(Pae)对二乙基亚硝胺(DEN)诱发大鼠肝癌前病变的预防作用，并探讨其作用机制。方法：采用腹腔注射DEN诱发大鼠肝癌前病变模型。雄性wistar大鼠按照体质量随机分成3组：对照组、模型组、丹皮酚组。造模给药16周后处死大鼠，观察各组大鼠一般状况，进行肝脏病理组织学检查，检测肝功能指标ALT、AST、GST、TBIL，脂质过氧化指标LPO、SOD、INOS、GSH-PX。结果：病理组织学显示，丹皮酚可以显著降低肝细胞异型增生灶和异型增生结节数目；降低血清中异常升高的ALT、AST、TBIL、GST、INOS、LPO水平，升高血清中降低的SOD、GSH-PX水平。结论：丹皮酚对于大鼠肝癌前病变具有一定程度的预防保护作用，其保护机制可能与改善肝功能，提高抗氧化能力，抑制脂质过氧化反应有关。

肝癌前病变是指在慢性肝病中出现的肝细胞不典型增生、腺瘤样增生、肝细胞再生结节、肝细胞小管状化生和卵原细胞增生，其发展为肝癌的几率高，尤其是肝硬化病灶中出现的异型增生病灶或结节和异型增生细胞[1]。对于肝癌前病变，西医学主要采用肝移植、手术治疗、化学治疗、放射治疗、消融术等,但是患者复发率高，预后差，且给患者造成一定的痛苦[2]。采用预防干预的办法来延缓或阻断肝癌前病变的发生，使之无法进展成肝癌，可达到防病治病的目的。牡丹皮为毛茛科植物牡丹的根皮和萝藦科植物徐长卿的全草，主产于陕西、山东、湖南、湖北等地。味苦、辛，性微寒，归心、肝、肾经，具有清热凉血，活血化瘀的作用，用于热入营血、温毒发斑、夜热早凉、经闭痛经、跌扑伤痛、臃肿疮毒等症[3]。牡丹皮主要含有丹皮酚(Paeonol,Pae)等活性成分,具有抗肿瘤、抗菌、增强免疫力、降压、促进微循环等药理作用[4-5]。本试验以二乙基亚硝胺(DEN)腹腔注射诱发肝癌前病变大鼠模型，研究丹皮酚对肝癌前病变的预防作用，观察丹皮酚对大鼠肝癌前病变组织病理学的改善和肝功能指标、过氧化指标的影响，为丹皮酚的进一步临床合理应用提供实验依据。

1　材料

1.1实验动物SPF级Wistar大鼠26只，雄性，体重(220±10)g，购于北京维通利华实验动物公司，许可证号SCXK(京)2010-0013，饲养于北京中医药大学实验动物中心(SPF级)。实验过程严格遵守动物实验室有关规定。

1.2材料和仪器丹皮酚原料药(广西亿康药业股份有限公司,批号101021)；二-乙基亚硝胺(DEN,美国Sigma公司,批号1000928405，密度0.95 g· mL-1)；丙氨酸转氨酶(ALT)试剂盒、天冬氨酸转氨酶(AST) 试剂盒、总胆红素(TBIL) 试剂盒、谷胱甘肽硫转移酶(GST) 试剂盒、脂质过氧化物酶(LPO)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD) 试剂盒、诱导型一氧化氮合酶(INOS)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX) 试剂盒(南京建成生物工程有限公司)；Multiskan MK3 酶标仪(上海热电仪器有限公司)；LG16-W型台式冷冻离心机(北京京立离心机)；vortex-genie2漩涡混合器(北京卓信伟业科技有限公司)；JM-B型万分之一电子天平(余姚市纪铭称重校验设备有限公司)；44x3显微镜(上海光学仪器一厂)；FS/FAS5030石蜡切片机( 德国 LETIZ公司)

2　方　法

2.1大鼠肝癌前病变模型的建立及给药参照文献[6]，将26只大鼠按照体重均衡原则随机分为对照组大鼠6只、模型组和丹皮酚组大鼠各10只。适应性喂养1周后，模型组和给药组均以 0.5 mL/100 g的DEN腹腔注射,每周50 mg/kg，连续给药16周；对照组给予等体积生理盐水。同时给予丹皮酚进行预防：用0.5%CMCNa溶解丹皮酚配制成混悬液，按194.4 mg/kg的剂量给大鼠灌胃给药，每天1次，连续16周，对照组和模型组给予同体积生理盐水。

2.2取材各组大鼠均按照安排时间和剂量的DEN(0.5 mL/100 g)腹腔注射,末次注射后84 h,以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，分离血清保存于-80℃，统一切取肝脏右叶2x4x6 mm3组织块，4% 多聚甲醛溶液固定 48 h，石蜡包埋，切片，同步烤片与脱蜡，梯度酒精水化，HE染色。病理评价肝病变的性质和程度。

2.3生化指标采用酶标仪检测，严格按照试剂盒说明书进行，测量指标为ALT、AST、TBIL、GST、SOD、LPO、GSH-PX、iNOS。

3　结　果

3.1肝脏组织病理表现从HE染色可以看出，对照组：肝小叶和汇管区结构正常。以中央静脉为中心，肝细胞索呈放射状排列，核圆，染色质稀疏，核膜清晰。无显著变性与坏死，无水肿、出血与浸润。模型组：以肝细胞变性与增生为主要病变。水肿的肝细胞体积增大，部分肝小叶出现肝细胞坏死。肝细胞异型性增生，细胞核体积大，染色深与形态怪异，汇管区可找到淋巴细胞浸润和胆管增生。丹皮酚组：病变性质与模型组相似，但是有缓解趋势。增生细胞异型性变小，少见双核细胞。汇管区有淋巴细胞浸润和胆管增生。结果见图1。

3.2生化指标检测

3.2.1 Pae对大鼠肝癌前病变肝功能的影响：与对照组比较，模型组ALT、AST、TB、GST异常升高，有极显著性差异(P<0.01),与模型组比较，丹皮酚可减轻血清中异常升高的ALT、AST、TB、GST水平，有极显著性差异(P<0.01)。试验结果提示丹皮酚能明显改善肝功能损伤，且对损伤肝细胞具有一定的修复能力，结果见表1。

表1　Pae对模型大鼠肝功能的保护作用±s)

注：t-test与对照组比较,△P<0.05, ▲P<0.01；与模型组比较, □P<0.05, ■P<0.01

3.2.2Pae对肝癌前病变大鼠脂质过氧化指标的影响：与对照组比较，模型组大鼠GSH-PX、SOD明显降低，有极显著性差异(P<0.01),模型组大鼠INOS，LPO明显升高，有极显著性差异(P<0.01)；丹皮酚可明显增加SOD，GSH-PX含量(P<0.01)，且降低血清中LPO，INOS的含量(P<0.01，P<0.05)。SOD和GSH-PX的变化提示丹皮酚可清除氧自由基，显著提高机体的抗氧化能力；INOS和LPO的变化提示丹皮酚可减少脂质过氧化物对肝细胞和组织的氧化性损伤，从而明显改善体内的脂质过氧化水平，结果见表2。

表2　Pae对模型大鼠脂质过氧化的保护作用±s)

注：t-test与对照组比较,△P<0.05, ▲P<0.01；与模型组比较, □P<0.05, ■P<0.01

4　讨　论

转氨酶和总胆红素的血清水平是肝功损伤的重要标志，ALT水平的升高是因为DEN引起的肝细胞损伤使酶外泄到细胞外，通常伴随着AST水平的升高。在本文研究中，相对于模型组，丹皮酚组可以显著地减少血清ALT、AST、GST 和 TBIL的水平，暗示了丹皮酚对于DEN引起的肝毒性具有潜力的保护作用。

脂质过氧化是自由基引起细胞损伤的一个主要机制。据相关文献报道，DEN的摄入可形成脂质过氧化产物如MDA，MDA可以和各种微粒相互作用引起氧化应激压力，进而促使癌症的发生。在癌症形成阶段，LPO也会随着DEN的摄入不断升高，这一动态作用可能会进一步导致自由基的大量升高，从而破坏了细胞的抗氧化防御能力[7]。在本文研究中，模型组的LPO水平不断升高，丹皮酚组降低了LPO水平，这可能是因为丹皮酚具有清除自由基的能力。

对于内生的、外在的毒性化合物如化学致癌剂、活性氧引起的细胞损伤，抗氧化酶可以起到主要的预防作用[8]。SOD 和 GPx具有对活性氧的直接清除作用[9]，GPx的抗氧化能力比SOD更强，能够对更多的过氧化物进行清除[10-11]。SOD可以清除超氧阴离子自由基和有害的氧化剂[12],作为对付超氧自由基的第一道防线。这些抗氧化酶活动的减少可能是由于DEN代谢过程中自由基的大量产生所导致[13]。本文研究中，模型组动物存在抗氧化酶活动的减少，可能是由于DEN代谢过程中不断增加的活性氧的产生导致。丹皮酚组抗氧化酶活动增加，这可能是因为丹皮酚对自由基的清除作用。

实验结果显示，丹皮酚组的肝功指标和脂质过氧化指标都有所改善，结合病理组织学观察，说明丹皮酚在一定程度上对大鼠肝癌前病变能起到一定的预防保护作用。其作用机制可能与改善肝功能、抑制脂质过氧化反应，提高抗氧化能力有关。该研究结果对于促进丹皮酚抗肝癌前病变作用机制的深入研究提供了一定的科学依据。

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(收稿2015-05-27；修回2015-07-01)

R258.5

Adoi:10.3969/j.issn.1000-7369.2015.09.086

*北京中医药大学创新团队基金资助项目(2011-CXD-04)

▲北京中医药大学基础医学院(北京100029)

□中国医学科学院药用植物研究所(北京100193)

主题词肝肿瘤，实验性丹皮酚二乙基亚硝胺