屈园园杨 洪普雄明
新疆地区水痘带状疱疹病毒临床分离株基因型分析
屈园园1杨 洪2普雄明1
目的: 明确新疆地区水痘-带状疱疹病毒(VZV)流行的主要基因型。方法: 采集6例水痘和119例带状疱疹患者的水疱液,提取标本中的DNA,PCR扩增ORF22、38、54、62 DNA片段并测序,测序结果与GenBank中的VZV参考株基因序列进行比较,并用DNAMAN软件分析核酸序列和酶切位点。结果: PCR后电泳显示125份疱液标本中有120份VZV阳性。通过ORF22酶切位点分析,120份VZV临床分离株经序列对比J型79株,M1型40株,E型1株;通过ORF38、54酶切位点分析,119例VZV临床分离株为Pst I+Bgl I+型,1株VZV为Pst I+Bgl I-型;通过ORF62酶切位点分析,120株毒株均为Sma I-,都是野生株。结论: 新疆地区水痘-带状疱疹病毒临床分离株主要为J型野生株。
水痘带状疱疹病毒; 基因型; 单核苷酸多态性
水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)属疱疹病毒α亚科,称人类疱疹病毒3型(human herpesvirus 3,HHV-3)。人类对VZV普遍易感,引起水痘和带状疱疹。水痘减毒活疫苗预防接种显著降低了水痘和带状疱疹后遗神经痛发生率,但水痘疫苗不能提供100%的保护,约有5%儿童和10%成人仍有可能感染VZV,其中由疫苗株引起的占40%,称为“突破”感染,这些感染者的临床表现比野生毒株所引起的轻得多。1,2不仅如此,疫苗也可以与野毒株一样,潜伏在疫苗接种者的感觉神经节中,并能被再激活而引发带状疱疹。因此在广泛使用减毒活疫苗的同时,有必要检测水痘和带状疱疹病例中VZV毒株是否由疫苗株引起。3
VZV基因组保守,为 124884bp的线状双链DNA,包含71个开放读码框,病毒株间的差异小于0.2%,但是不同毒株间在基因序列上却存在差异,因此从基因学上探索不同毒株间的差异及基因分型对水痘-带状疱疹病毒疫苗的研究及VZV感染的控制具有重要意义,并越来越受到世界各国的重视。目前的VZV基因分型方案多基于单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)进行,如基于散在SNPs方案,4,5分析 VZV ORF-1、-21、-50和-54中的SNPs;基于ORF22中6个SNP位点方案;6基于糖蛋白/IE62方案。7
本文则对来自新疆地区125例水痘和带状疱疹患者临床标本进行分析,明确新疆地区VZV的基因型并鉴别其野毒株或疫苗株属性。
1.1研究对象 选取2012年4月至2013年1月,本科门诊或住院临床确诊为水痘或带状疱疹患者共125例,其中水痘6例,年龄5~29岁,平均16.83±10.30岁,男2例,女4例,汉族3例,维族2例,回族1例,病程1~7天,平均3.48±2.39天;带状疱疹119例,年龄13~96岁,平均53.88±17.61岁,男57例,女62例,汉族70例,维族41例,回族8例,病程5~14天,平均8.37±4.26天,所有患者均有典型临床症状和体征,符合水痘或带状疱疹的诊断标准,8出生并长期生活在新疆地区,对每一个患者询问并记录有无VZV疫苗接种史,发病前有无异地外出史。排除标准:非出生于新疆地区的患者,或虽出生于新疆地区但并未长期居住的患者;诊断不明确的;病程超过2周的;不愿配合或无法配合本研究的患者。
阳性对照:来源于冻干水痘减毒活疫苗(v-Oka),购自乌市天山区社区服务部(批号:S20083005)。
1.2方法 临床标本收集:首先清洁皮损处,用无菌注射器挑破水疱,用无菌拭子从水疱的一边开始向另一边按压擦拭水疱,收集水疱液,待拭子室温干燥,将拭子折断,放入1.5 mL EP管中,-20℃条件下保存备用。
DNA提取:将0.5 mL无菌生理盐水加入带有拭子的EP管中,剧烈振荡以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等,待其自然沉淀,吸取上清液。用TIANamp Virus DNA/RNA Kit(北京天根生化科技有限公司)提取总DNA。v-Oka DNA可从减毒活疫苗中直接提取。所有提取DNA经紫外分光光度法确定浓度以后,置-20℃保存备用。
PCR采用 VZV各相关基因的特异性引物6,9,10(表1),用PCR扩增ORF22、38、54、62 DNA片段,使用即用PCR扩增试剂盒(上海生工生物有限公司)。按照以下反应条件进行:使用Touchdown PCR,首先94℃ 4 min热启动,在接下来的10个循环中每个循环为94℃ 1 min,56℃(0.4℃↓)45 s,72℃ 1 min;随后的20个循环为94℃1 min,52℃45 s,72℃ 1 min;最后72℃延伸7min。PCR反应完成后,分别取2μL ORF22、38、54、62的PCR产物,经1%的琼脂糖凝胶100V电泳35 min,电泳后的凝胶经溴乙锭染色,拍照分析结果。
序列测定与基因型判定:PCR产物经电泳验证阳性后送上海生工公司测序。从GenBank数据库下载VZV各基因型参考株的序列资料,采用DNAMAN软件进行相关对比分析基因型及酶切位点。
表1 VZV基因分型的引物
2.1扩增产物鉴定 共采集临床确诊水痘或带状疱疹患者的水疱液标本125例,其中6例水痘有4例核酸检测阳性,119例带状疱疹有116例核酸检测阳性,核酸阳性标本共120例,阳性率96%。ORF22、38、54、62的PCR产物分别在447 bp、647 bp、497 bp、268 bp处有一明显的特异性条带,鉴定为水痘带状疱疹病毒(图1)。
2.2序列分析结果 本研究参考Loparev等62004年报道的基因分型方法,按ORF22中6个SNPs位点(37902、38019、38055、38081、38177、38229)碱基突变组合,能够准确地将VZV分为E、M1、M2、J四种主要基因型。新疆地区120份VZV临床分离株ORF22的PCR产物测序后分别与基因库中Dumas、CA123、DR、pOka、vOka等参考株对比后发现,基因型J有79株,基因型M1有40株,基因型E有1株(表2)。
2.3酶切位点分析
2.3.1ORF38(Pst I)酶切位点分析 ORF38的PCR产物为647 bp,如果该片段中存在Pst I位点,则被切成357 bp和290 bp两个片段。采用DNAMAN5.2.2软件进行酶切位点分析测序结果及基因库中Dumas、CA123、DR、pOka、vOka参考株,120例VZV临床分离株、Dumas、CA123、DR参考株均含有Pst I酶切位点,而pOka、vOka参考株、疫苗则没有相应的Pst I酶切位点,与之前的报道一致。11
2.3.2ORF54(Bgl I)酶切位点分析 ORF54的PCR产物为497 bp,如果该片段中存在Bgl I位点,则被切成256 bp和241 bp两个片段。分析表明 CA123、DR、pOka、vOka参考株、119例VZV临床分离株、疫苗含有Bgl I位点,而Dumas、1例VZV临床分离株(VZV-005)没有相应的Bgl I酶切位点。此外结果发现VZV-062在ORF54 SNP95250发生了T代替了C,提示其基因可能发生了点突变。
2.3.3ORF62(Sma I)酶切位点分析 ORF62的PCR产物为268 bp,疫苗株比野生株在该片段中多一个Sma I位点,这是鉴别VZV野生毒株和疫苗株的主要方法之一。12结果显示vOka参考株、疫苗多一个Sma I位点,而Dumas、CA123、DR、pOka参考株、120例VZV临床分离株均缺少一个Sma I酶切位点。故表明新疆120份VZV病毒株均为野生株。
图1 VZV临床分离株ORF22、38、54、62的PCR产物凝胶电泳图
表2 新疆地区120株VZV临床分离株的基因型
2.4E型Pst I+Bgl I-VZV毒株来源及“突破”感染情况 通过上述分析可知119例VZV临床分离株为Pst I+Bgl I+型,1株VZV为Pst I+Bgl I-型(此株后被证实为E型毒株)。对E型Pst I+Bgl I-VZV毒株感染的患者资料调查发现,此患者为63岁维族女性,乌鲁木齐人,发生带状疱疹前1周曾至西安旅游,考虑带状疱疹是潜伏在体内的VZV再激活所致,故此型仍属于新疆VZV病毒基因型的特点。与此同时,我们对所收集样本中6例水痘患者进行再次追溯研究,确认在发病前无流动及异地外出史。
本次收集的新疆地区120份VZV临床分离株均为野生株,进一步对这120例患者的v-Oka预防接种史进行调查显示4例水痘患者中2例有明确的水痘疫苗接种史(未提供接种卡及时间),而116例带状疱疹患者均表示预防接种史不详,可见新疆地区也出现了疫苗的“突破”感染,这种突破由野生株所引起。进而我们再对这2例发生疫苗突破感染的患者进行临床资料分析,显示2例患者均为女性,分别为汉族和维族,在临床表现皮疹数量均大于50个,1例维族女性有高热的症状,2例均无并发症。
VZV的基因型分布具有密切的地理相关性,不同基因型的毒株在各个国家和地区的分布不同。J型主要分布于日本、朝鲜、蒙古等亚洲国家;M1、M2型主要分布在热带和亚热带;E型主要分布在温带、欧美等国家。6中国关于VZV分离株基因型的报道也逐渐增多,杨吉星等132008年报道上海地区1株VZV基因型为 J型;周小勇等142009年报道武汉地区78株VZV基因型均为J型;刘静静等122009年报道安徽省19株VZV基因型均为J型;王艳等152012年报道辽宁省3株VZV基因型均为J型;陈婷婷等162012年报道福建省44株VZV基因型均为J型;马瑞等172012年报道宁波市15株VZV基因型,J型13株,M1型2株;刘兰等182012年报道西藏地区10株VZV基因型,J1型3株,A1型3株,A2型4株。可以看出J型毒株目前为国内流行的主要毒株,而西藏由于地位位置特殊,VZV基因型也呈现出多样性。本文采用ORF22中6个SNPs位点碱基突变组合,6将新疆地区120份VZV临床分离株分为J型79株,M1型40株,E型1株,结果符合新疆独特的地理分布特点,首先新疆地处亚洲,所以在亚洲流行的基因型J型在新疆占据65.8%;其次新疆南部与巴基斯坦、印度接界,所以出现了非洲、印度的基因型M1型;再次北疆与俄罗斯联邦接壤,流行于欧美的E型也在新疆出现。在美国、英国等西方国家中,绝大多数野毒株为Pst I+Bgl I-,19本文所分离的120例VZV临床毒株在ORF38都存在Pst I酶切位点,这和美国20、英国21、印度22的报道相似,但与同处亚洲的日本不同;9另外,本文119例新疆VZV临床分离株在ORF54都含有Bgl I酶切位点,这与西方的情况有明显区别。在美国和英国,只有19%~20%的毒株含有Bgl I酶切位点,20,21而印度22及国内合肥、武汉12,14的研究和我们的结果类似,即所有分析的毒株均含有Bgl I酶切位点。故以往认为温带地区除日本外主要流行ORF54(Bgl I-)病毒株,这一观点可能要重新认识。
对于研究中仅1例E型Pst I+Bgl-VZV临床分离株,分析原因可能由于本次研究样本量不大及来源较单一有关,有待今后进一步扩大样本,针对新疆地区地理位置独特且具有民族代表性的地方进行分层整群抽样。
通过上述与国内外基因型比较,结果显示新疆地区VZV在遗传特征上即具有高度保守性又具有多态性,保守性表现为扩增的VZV序列之间变化较小、相似度高,而多态性则体现在单核苷酸多态性上,即根据这种特性我们将VZV分为不同亚型。这与中国其他地区相比具有独特性,再次印证了VZV基因型的分布有着显著地理差异。
本文通过分析VZV临床分离株Sma I酶切位点,同时结合v-Oka预防接种史可以看出水痘疫苗接种并不能为接种者提供100%的保护,在新疆地区也出现了疫苗的“突破”感染,这种突破由野生株所引起;我们对这2例发生疫苗突破感染的患者进行临床资料分析,发现其临床症状与未接种v-Oka的水痘患者无明显差别,这一结果与相关文献有所区别。因为水痘突破病例的临床特征通常表现为症状轻、皮损少于50个,23较少有发热症状出现,24无严重并发症发生,25病程也明显缩短;24而国内张雪等26发现少数水痘突破病例出现了肺炎等较重的并发症,这与我们报道相似。本文所研究的带状疱疹均为野毒株感染所致,不存在疫苗株感染现象,但就v-Oka的高覆盖率是否会导致带状疱疹发病率升高这一观点,由于需要对新疆地区带状疱疹发生率的动态变化进行监测,而相关数据也未见报道,所以尚未得出结论。
至今水痘尚未纳入我国法定传染病管理,而在基因型别研究上新疆基本上处于空白阶段,虽然目前离特异性使用疫苗还要做很多研究,但本实验结果可以为新疆地区的水痘及带状疱疹的防治提供理论依据和临床参考。
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(收稿:2015-03-16)
·临床研究·
Genotypic analysis of clinical varicella-zoster virus isolates in Xinjiang
QU Yuan-yuan,YANG Hong,PU Xiong-ming.Department of Dermatology,People's Hospital of Xinjiang Uyaur Autonomous Region,Urumqi,830001
Objective:To genotype varicella-zoster virus(VZV)strains isolated in Xinjiang.M ethods:DNA was extracted from the blisters fluid in 6 patientswith chickenpox and 119 patientswith zoster.PCR and nucleotide sequencing were performed on the partof open reading frames(ORF)22,38,54 and 62.To confirm the genotypes of isolated virus strains,the gene sequences obtained from PCR products were compared with that in GenBank of VZV strains,and the restriction enzyme sites were analyzed through DNAMAN software analysis.Results:One hundred and twenty samples of 125 were positive of VZV.Restriction enzyme site analysis of ORF 22 showed that 79 strains were genotype J,40 were genotype M1 and 1 was genotype E.Restriction enzyme site analysis of ORF38,54 showed 119 strainswere Pst I+Bgl I+,and 1 strain was Pst I+Bgl I-.Analysis of ORF 62 showed 120 strainswere all wide-type Sma I-.Conclusion:Genotype Jof the VZV isolates is themajor wild strain in Xinjiang region.
varicella-zoster virus;genotype;single nucleotide polymorphism
新疆维吾尔自治区人民医院科研基金资助项目(编号:20130102)
1新疆维吾尔自治区人民医院皮肤科,乌鲁木齐,830001 2新疆维吾尔自治区人民医院北院皮肤科,乌鲁木齐,830001