内蒙古汉族寻常型银屑病GJB2基因rs72474224位点检测

刘 佳 黄艳平 丁文媛 孙志强 杨俊君 韩建文吕新翔 乌日娜

内蒙古汉族寻常型银屑病GJB2基因rs72474224位点检测

刘 佳 黄艳平 丁文媛 孙志强 杨俊君 韩建文*吕新翔 乌日娜*

目的： 检测内蒙古汉族寻常型银屑病GJB2基因rs72474224位点的多态性。方法： 提取294例寻常型银屑病患者及287名正常对照外周血DNA，利用PCR和连接酶检测反应检测GJB2基因rs72474224的多态性。结果： SNP rs72474224等位基因T在病例组和对照组中的频率分别为0.03571和0.01045，差异具有统计学意义（P=0.004267）。结论： GJB2基因多态性rs72474224可能与内蒙古汉族人群寻常型银屑病的易感性相关。

寻常型银屑病； GJB2

银屑病是一种以红斑、鳞屑为主要表现的慢性增殖性炎症性皮肤病，根据临床表现不同主要分为4种类型，其中以寻常型银屑病最多见，占所有病例90%以上。在中国银屑病发病率大约为0.123%。1近年来，遗传关联研究发现一大批银屑病相关的易感基因。22014年，Tang等3通过全基因组外显子测序方法发现GJB2基因的一个错义突变（rs72474224，c.324C＞T，p.Val37Ile）与中国汉族人群银屑病易感性相关。为进一步证实其研究结果，本研究利用连接酶检测反应（ligase detection reaction，LDR）对rs72474224进行基因分型，探讨其与汉族人群寻常型银屑病的相关性。

1　资料和方法

1.1资料 研究对象：从内蒙古医科大学附属医院收集寻常型银屑病患者294例，正常对照287例。经知情同意并签字后抽取外周静脉血5 m L，EDTA抗凝，置于-80℃冰箱保存备用。所有患者经临床及病理证实诊断，符合寻常型银屑病诊断标准。所有对照排除银屑病及其他自身免疫疾病，排除银屑病家族史。本研究经过内蒙古医科大学附属医院伦理委员会通过，并在实施过程中遵守赫尔辛基宣言。

1.2方法

1.2.1基因组DNA提取 利用AxyPrep，AP-MX-BL -GDNA-25基因组DNA提取试剂盒提取患者及对照基因组DNA，利用分光光度仪检测260 nm和280 nm吸光度，计算DNA浓度。并利用凝胶电泳检测DNA质量，所有DNA样本均合格。

1.2.2引物及探针的合成 利用 Primer 3 online（Version 0.4.0）软件（http：//frodo.wi.mit.edu/）和Oligo（Version 6.31）（Molecular Biology Insights Inc.，USA）软件设计特异性引物和LDR探针，针对该基因位点设计两条引物，要尽量保证所有基因位点的引物T值相同，PCR反应引物序列见表1。根据LDR探针设计原则设计LDR的上下游探针，4上游探针5'端用磷酸化修饰，LDR反应探针序列见表2。

表1　PCR反应引物序列

1.2.3多重PCR反应 PCR反应体系为（20μL） 1 μL模板，2μL Buffer缓冲液，0.6μL Mg2+，2μL dNTP，0.2μL TaqDNA聚合酶，2μL引物混合液，加水补足。PCR反应条件：95℃预变性2 min；94℃30 s。56℃退火1.5 min。65℃ 30 s，40个循环。最后65℃延伸10 min。

1.2.4多重LDR反应 LDR反应体系为（10μL）

1μL Buffer缓冲液，1μL探针混合液，0.05μL Taq DNA连接酶，4μL PCR产物，加水补足10μL。探针混合液浓度为2 pmol/μL。LDR反应条件：95℃ 2 min预变性，94℃15 s，50℃ 25 s，进行40个循环。

1.2.5测序与基因分型 反应产物经过，ABI3730测序仪测序分析，最后用Genemapper软件进行数据分析，判读各位点上的基因分型。

1.2.6统计学方法 对SNP数据质控、统计分析利用PLINK 1.07软件完成（http：//pngu.mgh.harvard. edu/purcell/plink/）。5计算其等位基因频率，病例组及对照中分别进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验。卡方检验（χ2）比较病例组及对照组等位基因频率，并计算等位基因的相对危险度估计值比值比OR及其95%可信区间（95%CI）。Fisher精确概率法比较病例组与对照组间的基因型频率，所有统计检验均为双侧概率检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1病例组及对照组质控 病例及对照样本在性别及年龄方面无显著性差异，具有可比性（P＞0.05），样本信息见表3。该SNP在对照中符合Hardy-Weinberg遗传平衡（P=1）。

2.2等位基因频率比较 经PLINK 1.07软件统计分析，SNP rs72474224的等位基因T在病例组和对照组中的频率分别为0.03571和0.01045，两组之间等位基因分布频率差异有统计学意义（P=0.004267，OR= 3.51，95%CI：1.41～8.75）。根据患者发病年龄进行分层分析发现，等位基因T在早发型银屑病（发病年龄小于40岁）中的频率更高（0.04545），明显高于对照组（P=0.0005621，OR=4.51，95%CI：1.77～11.46），而晚发型银屑病（发病年龄≥40岁）中的等位基因频率与对照组无显著性差异（P=0.5648）（表4）。

2.3基因型频率分布情况 为分析该SNP的遗传模式，分别按照累加、隐性、显性三种模式下比较病例组与对照组的基因型频率。利用Fisher确切概率法进行分析，发现在显性模式下最为显著（P=0.009），而且在早发型银屑病中差异更为显著（P=0.002），晚发型银屑病与对照组间基因型分布在三种模式下均无显著性差异（P＞0.05）（表5）。

表3　寻常型银屑病及对照组样本信息

表4　寻常型银屑病和对照中rs72474224等位基因频率分布

表5　寻常型银屑病和对照中rs72474224基因型分布

3　讨论

2010年，Sun等的全基因组关联分析研究首次报道GJB2基因多态性与银屑病易感性相关。62014年全基因组外显子测序研究3再次证实GJB2基因与银屑病的关系，发现位于GJB2基因上错义突变与银屑病相关联。

GJB2基因定位于13q11-12区域，全长为4804 bp，编码区为678 bp，由两个外显子组成，即一个简短的外显子1（exon1）和一个长蛋白编码外显子 2（exon2），编码区主要存在于exon2，编码在耳蜗和表皮中表达的β类缝隙连接蛋白Connexin26（Cx26）。Cx26蛋白包括 2个胞外域（extracellular domain，EC），3个胞内域（intracellular，IC），4个跨膜域（tans menbrane domain，TM）、细胞质氨基末端和羧基末端，它存在于很多的细胞和组织中，包括耳蜗，手掌和脚掌，毛囊和汗腺。7GJB2基因突变包括移码突变、缺失、插入等，可产生有功能缺陷或无功能的Connexin26蛋白，在其蛋白翻译及通道蛋白聚集水平产生影响。这个域的突变会导致Cx26的渠道活动受到干扰和听觉器官的间隙连接因子的功能缺陷。既往研究发现Cx26的突变均与常染色体隐性非综合性耳聋（ARNHL），常染色体显性综合性耳聋（ADHL）和掌跖角化症（PPK）有关。8Bowcock等发现Cx26在银屑病皮损中表达上调。9缺乏转录因子Kruppel-likefactor 4（Klf4）的缺陷小鼠在表皮屏障的表达上产生严重缺陷。Klf4缺陷的新生儿皮肤也显示出与斑块状银屑病皮损相似的基因表达改变，并且缝隙连接蛋白Cx26的表达也显著上调。10免疫组化法证实Cx26在银屑病患者皮损区表皮全层有表达，且蛋白表达量较非皮损区及正常对照显著增加。8Cx26转基因鼠的皮肤出现银屑病样皮损，并具备角质形成细胞过度增殖、分化不全及皮肤屏障功能缺陷等银屑病皮损特征。8这些研究都提示GJB2基因与银屑病的发病密切相关，可能在维持角质形成细胞增殖和分化平衡中发挥重要作用。

本研究结果显示rs72474224在银屑病中突变频率高于正常人，与Tang等3研究结果类似，均能增加银屑病发病风险。证实了其与中国汉族人寻常型银屑病的相关性，更进一步提示GJB2基因在银屑病发病机制中发挥着重要作用。但是该错义突变如何影响Connexin26蛋白的翻译及功能仍需要进一步功能学研究。

1 Zhang XJ，HuangW，Yang S，etal.Psoriasis genome-wide association study identifies susceptibility variantswithin LCE gene cluster at 1q21.Nat Genet，2009，41（2）：205-210.

2 Zhang X.Genome-wide association study of skin complex diseases.JDermatol Sci，2012，66（2）：89-97.

3 Tang HY，Jin X，Li Y，et al.A large-scale screen for coding variants predisposing to psoriasis.Nat Genet，2014，46（1）：45-50.

4 Yi P，Chen Z，Yu L，et al.Development of a PCR/LDR/capillary electrophoresis assaywith potential for the detection of a beta-thalassemia fetalmutation inmaternal plasma.JMatern Fetal Neonatal Med，2010，23（8）：920-927.

5Purcell S，Neale B，Todd-Brown K，et al.PLINK：a tool set for whole-genome association and population-based linkage analyses.Am JHum Genet，2007，81（3）：559-575.

6 Sun LD，Cheng H，Wang ZX，etal.Association analyses identify six new psoriasis susceptibility loci in the Chinese population. Nat Genet，2010，42：1005-1009.

7 Evans WH，Martin PE.Gap junctions：structure and function（Review）.Mol Membr Biol，2002，19（2）：121-136.

8 Lucke T，Choudhry R，Thorn R，etal.Upregulation of connexin 26 is a feature of keratinocyte differentiation in hyperproliferative epidermis，vaginal epithelium，and buccal epithelium.J Invest Dermatol，1999，112：354-361.

9 Lizzul PF，Aphale A，Malaviva R，et al.Differential expressionof phosphorylated NF-kappaB/RelA treatmentwith etanercept.J Invest Dermatol，2005，124（6）：1275-1283.

10 Hollox EJ，Huffmeier U，Zee uwen PL，etal.Psoriasis is associated with increased beta-defensin genomic copy number.Nat Genet，2008，40（1）：23-25.

（收稿：2015-03-17 修回：2015-03-19）

·病例报告·

Detection of the polym orphism s of GJB2 gene rs72474224 in patients w ith psoriasis vu lgaris

LIU Jia，HUANG Yan-ping，DINGWen-yuan，et al.Department ofDermatology，the Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University，Hohhot，010050

Objective：To detect the polymorphisms of GJB2 gene rs72474224 in patients with psoriasis vulgaris in Han population in Inner Mongolia.M ethods：DNA was extracted from the peripheral blood of 294 patients and 287 controls.The polymorphisms of GJB2 gene rs72474224 were genotyped by PCR-based ligase detection reaction（PCR-LDR）.Results：The genotype frequencies of T in patients and controlswere0.0357 and 0.01045，with a significant difference（P=0.004267）.Conclusion：The polymorphism of GJB2 gene rs72474224 is associated with psoriasis vulgaris in Han population in Inner Mongolia.

psoriasis vulgaris；GJB2

国家自然科学基金（编号：31160192）

内蒙古医科大学青年创新基金项目（编号：NY2011QN005）

内蒙古自治区卫生和计划生育委员会医疗卫生科研计划项目（编号：201303057）

内蒙古自治区高等学校“青年科技英才支持计划”（编号：NJYT-14-B17）

内蒙古医科大学附属医院皮肤科，呼和浩特，010050