响应面优化超声波法提取牛血红蛋白工艺

赫玉兰，卢士玲，吴亚楠，王琦翔，田　盼

（石河子大学食品学院，新疆石河子832000）

响应面优化超声波法提取牛血红蛋白工艺

赫玉兰，卢士玲*，吴亚楠，王琦翔，田盼

（石河子大学食品学院，新疆石河子832000）

以牛血为原料，研究了超声波处理过程中水与红细胞体积比、超声时间、超声时间与间歇时间比、超声功率对血红蛋白提取率的影响。通过单因素实验确定各因素的范围，在此基础上采用响应面法对提取工艺参数进行优化。结果表明：水与红细胞体积比为4∶1，超声时间17min，超声时间与间歇时间比为1∶1，超声功率250W，血红蛋白提取率达到92.33%。

牛血，血红蛋白，超声波，响应面，提取工艺

牛血液营养丰富，蛋白质含量高达17.3%，其中大部分为血红蛋白存在于红细胞中，占总蛋白质的80%；血红蛋白由血红素和珠蛋白结合而成，每1分子血红蛋白由4分子珠蛋白和4分子亚铁血红素组成，珠蛋白约占96%，血红素占4%［1］。血红蛋白具有较高的应用价值，用途十分广泛。在食品工业中，血红蛋白既可作为肉品发色剂，又可作为食品加工助剂原料用来生产发泡剂和乳化剂；在医疗保健中，可将其制成补血营养剂用于治疗缺铁性贫血引起的各种疾病，血红蛋白的降解产物可制成氨基酸口服液、注射液及复合液用于补充强化各种氨基酸；在饲料工业中，还可做畜禽饲料的蛋白质和铁添加剂［2-3］。因此，对牛血红蛋白提取方法的选择及条件的优化有很重要的意义。目前，畜禽血液中提取血红蛋白的方法主要有超滤法［4］，膨胀床吸附层析法［5］，有机溶剂提取法等［6］，这些方法普遍存在提取速度慢，操作繁琐，成本较高，有机溶剂不易从产品中除尽等问题。本实验将利用超声波细胞破碎技术提取牛血液中的血红蛋白，并采用Design-expert软件进行Box-Behnken Design响应面优化分析，来满足实验对数据处理的要求，结果可信，并通过软件实现实验条件的寻优［7］，为血红蛋白的大规模利用和开发提供一定的理论基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

新鲜牛血石河子沙依巴克区定点屠宰场；透析袋；纱布；牛血红蛋白标准品中国食品药品检定研究院；柠檬酸钠、柠檬酸分析纯，天津市光复科技发展有限公司；无水葡萄糖分析纯，天津市天达净化材料精细化工厂；氯化钠分析纯，天津永晟精细化工有限公司；亚硫酸氢钠分析纯，中国医药公司北京采购供应站；氢氧化钠分析纯，天津市福晨化学试剂厂；聚乙二醇辛基苯基醚分析纯，江苏永华精细化学品有限公司。

Neofuge-15R台式高速冷冻离心机力康发展有限公司；VCX500超声波细胞粉碎机美国SONICS公司；BS2000S电子分析天平丹佛仪器（北京）有限公司；DK-8D数显恒温水浴锅金坛市医疗仪器厂；FDU-1200冷冻干燥机上海爱朗仪器有限公司；UVmini-1240紫外可见分光光度计岛津国际贸易（上海）有限公司。

1.2实验方法

1.2.1工艺流程

1.2.2操作要点

1.2.2.1抗凝ACD配制（柠檬酸0.48g，柠檬酸钠1.32g，葡萄糖1.47g，加水至100mL）。抗凝剂与血液的比例均为1∶6，然后用纱布过滤，过滤后放入冰柜0～4℃备用。

1.2.2.2离心将过滤后的血液置于离心机内，以3000r/min的速度离心15min，弃去上清液，收集下层红细胞。

1.2.2.3洗涤将收集到的红细胞用0.9%的5倍体积冷生理盐水，洗涤3次，洗去白细胞、血小板和血浆。

1.2.2.4超声波破碎取适量红细胞，加入0.1%～0.2% NaHSO3，加适当体积的水，放入超声波细胞破碎机中超声破碎一定时间［8］。

1.2.2.5离心将破碎后的红细胞溶液置于离心机内于8000r/min下离心30min，弃去下层细胞碎片。

1.2.2.6透析将血红蛋白溶液装入透析袋中，置于流动自来水中透析12h。

1.2.2.7巴氏杀菌将透析后的血红蛋白溶液置于60℃恒温水浴锅中水浴10h［9］。

1.2.2.8冷冻干燥将杀菌后的血红蛋白溶液倒入培养皿中，冷冻后，移入冷冻干燥机内进行干燥。

1.2.3血红蛋白浓度测定

1.2.3.1AHD-575试剂的配制准确称取聚乙二醇辛基苯基醚25.0g，加入0.1mol/L NaOH溶液至1L，过滤，室温下保存备用。

1.2.3.2标准曲线的制作将牛血红蛋白标准品配制成不同浓度的溶液，分别吸取0.2mL加入到30mL AHD-575试剂中，静置反应1～3min，在575nm波长下，以AHD-575试剂为空白，测定吸光度。以牛血红蛋白标准品的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，得出血红蛋白溶液浓度X与吸光度值Y的关系的标准线及回归方程［10-11］。

1.2.3.3血红蛋白含量计算于洁净的烧杯中吸取处理后的血红蛋白提取液样品0.2mL，以AHD-575的方法测定吸光度A575，查标准曲线求得血红蛋白含量。

1.2.4血红蛋白提取率计算根据标准曲线求出相当于样品吸光度的血红蛋白含量，按下式求血红蛋白提取率：

其中：Y为血红蛋白提取率（%）；C1为血液中血红蛋白浓度（g/L）；V1为血液体积（L）；C2为超声处理后血红蛋白浓度（g/L）；V2为超声处理后血红蛋白体积（L）。

1.2.5单因素实验

1.2.5.1水与红细胞体积比对提取率的影响分别量取20mL洗涤后红细胞于五个小烧杯中，并分别加入1、2、3、4、5倍体积的蒸馏水，超声时间15min，工作时间与间歇时间比1∶1，超声功率200W，置于超声波细胞粉碎机中破碎后8000r/min下离心30min，弃去下层细胞碎片，测定浓度，计算提取率。

1.2.5.2超声时间对提取率的影响分别量取20mL洗涤后红细胞于五个小烧杯中，分别加入3倍体积的蒸馏水，超声时间分别为5、10、15、20、25min，工作时间与间歇时间比为1∶1，超声功率200W，置于超声波细胞粉碎机中破碎后8000r/min下离心30min，弃去下层细胞碎片，测定浓度，计算提取率。

1.2.5.3工作时间与间歇时间比对提取率的影响分别量取20mL洗涤后红细胞于五个小烧杯中，分别加入3倍体积的蒸馏水，超声时间15min，工作时间与间歇时间比分别为1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1，超声功率200W，置于超声波细胞粉碎机中破碎后8000r/min下离心30min，弃去下层细胞碎片，测定浓度，计算提取率。

1.2.5.4超声功率对提取率的影响分别量取20mL洗涤后红细胞于五个小烧杯中，分别加入3倍体积的蒸馏水，超声时间15min，工作时间与间歇时间比为1∶1，超声功率分别为100、150、200、250、300W，置于超声波细胞粉碎机中破碎后8000r/min下离心30min，弃去下层细胞碎片，测定浓度，计算提取率。

1.2.6响应面实验在单因素研究的基础上，选取适当红细胞与水体积比、超声时间、超声时间与间歇时间比（下文简称间歇时间比）、超声功率为自变量，血红蛋白提取率为响应值，根据中心组合设计原理，设计响应面分析实验，因素水平见表1。每个处理重复三次。

表1　响应面因素水平编码表Table 1　The factor level coding table of response surface

1.2.7数据处理采用Origin 8.5软件绘制单因素实验折线图；采用Design-Expert 8.0.6软件进行实验设计及响应面分析，得到方差分析表，绘制响应面分析图。

2　结果与分析

2.1血红蛋白浓度标准曲线

以牛血红蛋白标准品的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，得出血红蛋白溶液浓度X与吸光度值Y的关系的标准曲线及回归方程y=0.0025x+0.0008，相关系数R2=0.9978，说明样品范围合适，方程可用于血红蛋白浓度测定的计算。

图1　AHD-575检测法的血红蛋白标准曲线Fig.1　The standard curve of hemoglobin by method of AHD-575

2.2各因素对血红蛋白提取率的影响

2.2.1水与红细胞体积比对血红蛋白提取率的影响由图2可知水与红细胞体积比对血红蛋白提取率影响明显。当其他因素一定时，随着水与红细胞体积比的增大，血红蛋白的提取率呈逐渐上升趋势，当水与红细胞体积比达到4∶1后，血红蛋白提取率增加缓慢。这是由于在正常血液中，红细胞膜内外两侧溶液的渗透压相等。红细胞分离出来并加入去离子水后，降低了细胞膜外溶液的渗透压，红细胞吸水而导致细胞膜胀裂，同时在超声波空蚀作用下加快了细胞破裂的速度［12］。考虑到加水体积在4∶1后，提取率增加缓慢，加水过多使血红蛋白浓度稀释，初步确定水与红细胞体积比为4∶1。

图2　水与红细胞体积比对血红蛋白提取率的影响Fig.2　Effect of water to red blood cell ratio（V/V）on extraction rate of hemoglobin

2.2.2超声时间对血红蛋白提取率的影响由图3可知，超声时间对血红蛋白提取率影响显著。当其他因素一定时，随着工作时间的延长，血红蛋白提取率呈逐渐上升趋势，当工作时间达到20min后，血红蛋白提取率增加缓慢。这是因为随超声时间的延长，红细胞受超声波空蚀作用时间越长，红细胞破碎越彻底，考虑到20min后产率增加缓慢，生产周期及能量消耗问题，初步确定超声时间为20min。

2.2.3超声时间与间歇时间比对血红蛋白提取率的影响由图4可知，超声时间与间歇时间比对血红蛋白提取率有一定的影响，当其他因素一定时，随着工作时间与间歇时间比的改变，血红蛋白提取率呈上升趋势。当工作时间与间歇时间比为1∶1后，血红蛋白的破碎度和提取率增加缓慢。这是因为工作时间越长，红细胞受超声波交替膨胀和压缩作用的时间也越长，细胞破碎越彻底，血红蛋白释放越完全。

图3　超声时间对血红蛋白提取率的影响Fig.3　Effect of ultrasonic operation time on extraction rate of hemoglobin

图4　超声时间与间歇时间对血红蛋白提取率的影响Fig.4　Effect of ultrasonic time to quiescent interval time ratio on extraction rate of hemoglobin

图5　超声功率对血红蛋白提取率的影响Fig.5　Effect of ultrasonic power on extraction rate of hemoglobin

2.2.4超声功率对血红蛋白提取率的影响从图5可看出，超声功率对血红蛋白提取率的影响明显。当其他因素一定时，随着超声功率的增大，血红蛋白提取率呈逐渐上升趋势，这是因为超声波强度越大，空蚀作用越剧烈，红细胞受到交替膨胀和压缩的力就越大，细胞膜上分子扩散速度也越快，血红蛋白释放越完全［13］。当超声功率达到250W后，血红蛋白提取率增加缓慢。考虑到能量消耗问题，初步确定超声功率为250W。

表2 响应面结果Table 2　The results of response surface

表3　回归方程方差分析Table 3　The Regression analysis of variance

2.3响应面法确定超声波提取血红蛋白最佳工艺参数

采用Design-Expert 8.0.6进行响应面设计，获得制备血红蛋白四因素三水平实验设计及结果，并对结果进行方差分析和实验验证，从而优化提取工艺［14］。

2.3.1响应面实验设计及结果对表2进行回归分析得到二次回归方程：

Y=92.86+2.46A+2.67B-2.10C-1.48D+1.42AB+ 7.07AC+1.98AD-7.29BC-1.21BD+2.87CD-15.01A2-19.02B2-3.86C2-12.31D2

由表3 F值可知，影响超声波法提取血红蛋白提取率的因素排序为B＞A＞C＞D，即水与红细胞体积比＞超声功率＞超声时间＞工作时间与间歇时间比。这与周玲等［8］研究结果：水与红细胞体积比＞超声功率＞工作时间与间歇时间比＞超声时间有所差异，可能是由于采用分析方法不同，产生误差来源不同造成。模型的一次项A、B，二次项A2、B2、C2、D2，交互项AC、BC对血红蛋白提取率影响极其显著（p＜0.01），一次项C、D交互项AD和CD对血红蛋白提取率影响显著（p＜0.05），因此，各因素对血红蛋白提取率的影响不是简单的线性关系。模型p＜0.0001，回归模型极其显著；失拟项p=0.1804，不显著；相关系数R2=0.9920，响应值的变化有99.20%与所选变量有关系，说明模型拟合程度良好，能较准确地预测和分析实际情况；模型的校正系数R2Adj=0.9841，说明不确定因素对实验结果的干扰小，实验误差小，该模型与数据拟合度良好，可以用此模型分析和预测超声波对血红蛋白提取的工艺结果［15-16］。

2.3.2响应面的交互作用及优化由图6可知，当水与红细胞体积比为4∶1，工作时间与间歇时间比为1∶1时，随着功率的增大，血红蛋白提取率呈先升高后下降趋势；功率一定时，随着超声时间的延长，血红蛋白提取率变化缓慢。分析结果表明，功率的主效应大于时间。

图6　功率与时间的交互作用对血红蛋白提取率影响的响应面Fig.6　Response surface interaction power and time effects on the extraction of hemoglobin

由图7可知，当水与红细胞体积比为4∶1，时间为20min，工作与间歇时间比不变时，随着功率的增大，血红蛋白提取率呈现先上升后下降趋势；功率一定时，随着间歇时间比的改变，血红蛋白提取率呈先上升后下降趋势。分析结果表明：功率和间歇时间比的交互作用对提取率存在较大的影响。

图7　功率与工作和间歇时间比的交互作用对血红蛋白提取率影响的响应面Fig.7　The response surface interaction power and ultrasonic time to quiescent interval effects on the extraction of hemoglobin

由图8可知，当超声功率为250W，工作时间与间歇时间比为1∶1，时间不变时，随着水与红细胞体积比增大，血红蛋白提取率呈先上升后下降趋势；水与红细胞体积不变时，随着时间的延长，血红蛋白提取率逐渐上升，趋于平缓。分析结果表明：水与红细胞体积比的主效应大于时间。

由图9可知，当超声功率为250W，水与红细胞体积比为4∶1时，时间不变，随着间歇时间比的改变，血红蛋白提取率呈先上升后下降趋势；工作与间歇时间比不变时，随着时间的延长，血红蛋白提取率变化缓慢。分析结果表明：间歇时间比和时间的交互作用对提取率的影响较大。

2.3.3验证实验由模型预测，当提取率达到最大值时，水与红细胞体积比为4.17∶1，超声时间为17.38min，工作时间与间歇时间比为1.15∶1，超声功率为247.88W，提取率可达到93.69%。为了检验响应面模型的有效性和可靠性，根据优化所得到超声波法最佳条件，均结合实际情况对其进行适当修正［17］。

在水与红细胞体积比为4∶1，超声时间17min，超声时间与间歇时间比为1∶1，超声功率为250W的实验条件下进行验证实验，血红蛋白提取率为92.33%，与丁楠等［11］的研究结果相比，提高了11.53%，该实验值与模型预测值（93.69%）的差值仅占预测值的1.5%。由此可以认为该实验模型选择合理。

图8　时间与水与红细胞体积比的交互作用对血红蛋白提取率影响的响应面Fig.8　The response surface interaction operation time and ratio of water to red blood cell effects on the extraction of hemoglobin

图9　工作与间歇时间比与时间的交互作用对血红蛋白提取率影响的响应面Fig.9　The response surface interaction ultrasonic time to quiescent interval and operation time effects on the extraction of hemoglobin

3　结论

在单因素实验的基础上，采用响应面实验设计优化了超声波法提取血红蛋白工艺，利用Design-Expert 8.0.6软件对实验数据进行分析拟合，得出了超声波法提取血红蛋白工艺的数学模型，结果表明水与红细胞体积比、超声时间、超声时间与间歇时间比、工作时间的二次项对血红蛋白的提取率影响显著，说明各因素对血红蛋白提取率的影响不是简单地线性关系。超声波法提取血红蛋白的最佳工艺条件为：水与红细胞体积比为4∶1，超声时间17min，超声时间与间歇时间比为1∶1，超声功率250W，血红蛋白提取率达到92.33%。因此，利用响应面分析对超声波法提取牛血红蛋工艺进行优化，可获得最优的工艺参数，从而为牛血液的开发和利用提供了理论基础。

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Optimization of ultrasonic extraction of bovine hemoglobin by response surface methodology

HE Yu-lan，LU Shi-ling*，WU Ya-nan，WANG Qi-xiang，TIAN Pan
（Food College，Shihezi University，Shihezi 832000，China）

The bovine blood was used as raw material to extract hemoglobin by means of ultrasonic.Effect of ratio（V/V）of water to red blood cell，operation time，ratio of ultrasonic time to quiescent interval and ultrasonic power on the extraction ration of hemoglobin were investigated.Through single factor test，their scopes were initially determined，and then the extraction technology parameters were optimized through response surface methodology.The results showed that:when the ratio（V/V）of water to red blood cell was 4∶1，the operation time was 17min，the ratio of ultrasonic time to quiescent interval was 1∶1，and the ultrasonic power was 250W，the extraction rate of hemoglobin was 92.33%.

bovine blood；hemoglobin；ultrasonic；response surface；process parameters

TS251.2

B

1002-0306（2015）10-0259-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.046

2014－08－18

赫玉兰（1990-），女，在读硕士研究生，主要从事畜产品加工方面的工作。

卢士玲（1976-），女，博士，副教授，研究方向：畜产品加工和质量安全。

新疆生产建设兵团科技型中小企业技术创新基金项目（2014BD002）。