微波协同纤维素酶提取玉米须绿原酸工艺优化

关海宁，乔秀丽，刁小琴，迟彩霞

（1.绥化学院食品与制药工程学院，黑龙江绥化152061；2.绥化学院食品分析与检测重点实验室，黑龙江绥化152061）

微波协同纤维素酶提取玉米须绿原酸工艺优化

关海宁1，2，乔秀丽1，2，刁小琴1，迟彩霞1

（1.绥化学院食品与制药工程学院，黑龙江绥化152061；2.绥化学院食品分析与检测重点实验室，黑龙江绥化152061）

利用响应面法对玉米须绿原酸的微波辅助酶提取工艺进行优化。在单因素实验的基础上，以微波时间、乙醇浓度、浸提时间为自变量，绿原酸提取量为响应值，研究各自变量交互作用及其对绿原酸提取量的影响。进一步得到微波协同纤维素酶提取玉米须绿原酸的最佳工艺条件：微波功率240W、微波时间27s、纤维素酶添加量1.4%、乙醇浓度70%、浸提时间1.25h，在此条件下玉米须绿原酸的提取量8.94mg/g。

玉米须，绿原酸，纤维素酶，微波，响应面

玉米须是禾本科作物玉米的花柱和柱头，是一种传统的中药材，可用于治疗糖尿病、高血压、胆结石、肾炎等多种疾病［1］。玉米须中含有多糖、黄酮、生物碱、绿原酸等活性成分具有调节免疫，抗癌细胞增殖，抑菌、抗氧化等多种作用［2-5］。我国玉米须资源丰富，但由于缺乏有效的利用，大部分被废弃。

玉米须绿原酸属酚类化合物，是一种重要的活性物质，具有降血压、降血脂、抑菌、抗氧化、抗肿瘤等多种生理功能。传统提取绿原酸的方法多为有机溶剂浸提，该法提取时间长，提取效果差。微波是近些年广大科研工作者用于天然植物有效成分提取的一项新技术，它具有高效、安全、节能、提取率高等特点［6］。纤维素酶能温和、有效的破坏植物的细胞壁，提高有效成分的溶出率［7］。目前国内外尚未见有关微波辅助纤维素酶提取玉米须绿原酸的研究报道。本文通过响应面分析法优化微波协同纤维素酶提取玉米须绿原酸的工艺，以期为玉米须的合理利用和开发提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

成熟玉米须绥化市农田采集，自然晾干，粉碎，过80目筛；绿原酸标准品北京中科三捷生物有限公司；纤维素酶（10U/mg） 黑龙江肇东日成酶制剂有限公司；其他试剂均为分析纯。

TU-1901型双光束紫外可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司；美的家用微波炉佛山顺德美的微波电器制造有限公司；RE-52A型旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂；SHZ-D型循环水式真空泵郑州长城科工贸有限公司。

1.2实验方法

1.2.1纤维素酶-微波提取工艺取3.00g玉米须粉于锥形瓶中，加入6mL蒸馏水搅拌均匀，于指定微波功率条件下微波相应时间后，取出晾凉后加入一定量的纤维素酶，并加入无水乙醇和蒸馏水使浸提溶液为一定体积分数的乙醇溶液且料液比1∶20（g/mL），再在50℃的水浴中浸提一定时间后，沸水浴灭酶5min，过滤除渣，所得滤液减压浓缩，再用60%的乙醇定容至25mL容量瓶，所得样待检测［8-9］。

1.2.2绿原酸提取量的计算最大吸收波长的确定：用60%的乙醇溶液溶解绿原酸标准品，得到绿原酸标准液（43mg/L），取适量绿原酸标准液于200～450nm波长范围内进行扫描，在波长327nm处有最大吸收峰，故最大吸收波长选择327nm。以下实验以327nm作为测定吸光度的波长。

标准曲线的制作：精密吸取以上绿原酸标准液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mL，分别置于10mL容量瓶中，加60%乙醇溶液定容，摇匀。用分光光度法在327nm波长条件下测定吸光值，以绿原酸标准样品质量浓度（X，mg/L）为横坐标，吸光度（Y）为纵坐标绘制标准曲线，得标准回归方程Y=0.0556X-0.0134，相关系数R2=0.9996。结果表明绿原酸浓度在5～25mg/L的范围内呈良好的线性相关性。

绿原酸含量的测定：取不同提取方法所得样品液0.2mL，于10mL刻度试管中，定容至4mL，按标准曲线制作的步骤进行，于波长327nm处比色测定其吸光值，以60%乙醇溶液为空白参比，然后根据线性回归方程计算出每毫升提取液中的绿原酸含量，再根据下式计算总绿原酸提取量。

式中：C—依据标准曲线计算出测定样液的质量浓度（mg/L）；V2—测定吸光度时样液的定容体积（mL）；V1—提取液总体积（mL）；V0—测定吸光度移取样液的体积（mL）；W—样品重量（g）。

1.2.3单因素实验

1.2.3.1微波作用功率对绿原酸提取量的影响微波时间30s，纤维素酶添加量1.0%，浸提剂乙醇浓度60%，料液比1∶20（g/mL），浸提温度50℃，浸提时间1.0h，考察微波作用功率（0、80、240、400、640、800W）对绿原酸提取量的影响。

1.2.3.2微波时间对绿原酸提取量的影响微波功率240W，纤维素酶添加量1.0%，浸提剂乙醇浓度60%，料液比1∶20（g/mL），浸提温度50℃，浸提时间1.0h，考察微波时间（0、20、40、60、80、100s）对绿原酸提取量的影响。

1.2.3.3纤维素酶添加量对绿原酸提取量的影响微波功率240W，微波时间20s，浸提剂乙醇浓度60%，料液比1∶20（g/mL），浸提温度50℃，浸提时间1.0h，考察纤维素酶添加量（0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%）对绿原酸提取量的影响。

1.2.3.4浸提剂乙醇浓度对绿原酸提取量的影响微波功率240W，微波时间20s，纤维素酶添加量1.4%，料液比1∶20（g/mL），浸提温度50℃，浸提时间1.0h，考察浸提剂乙醇浓度（40%、50%、60%、70%、80%）对绿原酸提取量的影响。

1.2.3.5浸提时间对绿原酸提取量的影响微波功率240W，微波时间20s，纤维素酶添加量1.4%，浸提剂乙醇浓度60%，料液比1∶20（g/mL），浸提温度50℃，考察浸提时间（0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h）对绿原酸提取量的影响。

1.2.4响应面实验设计在单因素实验的基础上，选取较佳的微波功率和纤维素酶添加量，以绿原酸提取量为评价指标，浸提时间、微波时间、乙醇浓度3个因素进行Box-Behnken中心组合设计实验［10］，确定最佳提取工艺条件，因素水平编码见表1。

表1　响应面实验因素和水平编码值Table 1　Coded values and corresponding real values of the optimization parameters tested in response surface analysis

1.2.5数据处理每个实验重复3次，结果表示为x± s。采用statistix 8.0（Analystical Software Inc.，USA）的Linear Models程序进行，用Tukey HSD程序对差异显著性（p＜0.05）或差异极显著性（p＜0.01）进行分析，采用Sigmaplot 11.0软件作图。

2　结果与分析

2.1单因素实验

2.1.1微波作用功率对绿原酸提取量的影响不同的微波作用功率对绿原酸提取量的影响结果见图1。

图1　微波功率对绿原酸提取量的影响Fig.1　Effect of microwave power on extraction rate of chlorogenic acid

图1看出，随着微波功率的提高，绿原酸提取量增加，这是因为逐渐增加的热量使细胞内水分汽化而实现微波破壁的能力逐渐加强，有效物质更易溶出。微波功率为240W时提取量显著提高（p＜0.05）。当微波功率继续提高时，由于较大的微波功率会使样品温度瞬间升高，使绿原酸变性造成其损失，故微波功率为240W为宜。

2.1.2微波时间对绿原酸提取量的影响不同的微波时间对绿原酸提取量的影响结果见图2。

图2　微波时间对绿原酸提取量的影响Fig.2　Effect of microwave time on extraction rate of chlorogenic acid

由图2看出，随着微波时间的延长，绿原酸提取量逐渐增加，20s时达到最大（p＜0.05），再随着微波时间的延长，提取量反而下降，这可能是由于微波时间过短，破壁不完全，而长时间的微波辐射会导致样品温度升高，使绿原酸变性，故微波时间选择20s为宜。

2.1.3纤维素酶添加量对绿原酸提取量的影响不同纤维素酶添加量对绿原酸提取量的影响结果见图3。

图3　纤维素酶添加量对绿原酸提取量的影响Fig.3　Effect of cellulase addition amount on extraction rate of chlorogenic acid

由图3看出，纤维素酶添加量在0.8%～1.4%的范围内，随着纤维素酶添加量的增加，绿原酸提取量显著增加（p＜0.05），这是因为纤维素酶能有效分解细胞壁中的纤维素，使有效物质更好的溶出。当添加量为1.4%以后，随着加酶量的增加，绿原酸提取量增加并不显著（p＞0.05），这可能是由于继续添加的酶已经没有足够的底物与之反应，因此绿原酸提取量变化不明显。故为了节省酶的用量，纤维素酶的添加量为选择1.4%为宜。

2.1.4浸提剂乙醇浓度对绿原酸提取量的影响不同的浸提剂乙醇浓度对绿原酸提取量的影响结果见图4。

由图4看出，随着乙醇浓度的增加，绿原酸提取量显著增加（p＜0.05），当乙醇浓度为60%时，提取量达到最大。随后随着乙醇浓度的继续增加，提取量反而显著（p＜0.05）下降，这可能是由于高浓度的乙醇一方面更易于挥发，使的乙醇浓度依然会降低；另一方面可能会溶出一些杂质，导致绿原酸的提取量下降，故乙醇浓度选择60%为宜。

2.1.5浸提时间对绿原酸提取量的影响不同的浸提时间对绿原酸提取量的影响结果见图5。

图4　乙醇浓度对绿原酸提取量的影响Fig.4　Effect of ethanol concentration on extraction rate of chlorogenic acid

图5　浸提时间对绿原酸提取量的影响Fig.5　Effect of extraction time on extraction rate of chlorogenic acid

由图5看出，随着浸提时间的延长，玉米须绿原酸提取量显著增加（p＜0.05）；当浸提时间大于1.5h后，随着浸提时间的延长，绿原酸提取量趋于平缓，差异不显著（p＞0.05）。这可能是由于当时间为1.5h时，绿原酸已基本浸出，从节约能源角度考虑，浸提时间选择1.5h为宜。

2.2响应面优化实验

2.2.1实验结果及方差分析在单因素实验的基础上，对浸提时间、微波时间、乙醇浓度进行三因素三水平响应面实验设计，结果见表2。

将表2所得数据采用Design Expert软件进行回归分析，三个因素经拟合得到以绿原酸提取量（Y）为目标函数的二次回归方程：

Y=－19.74542+13.93000X1+0.47808X2+0.34875X3－0.097500X1X2－0.094500X1X3+0.000925X2X3－1.87833X12－0.00779583X22－0.00154583X32。

回归模型的方差结果（表3）表明，浸提时间、微波时间、乙醇浓度对绿原酸提取量的影响极显著（p＜0.01），且大小顺序为微波时间（X2）、乙醇浓度（X3）、浸提时间（X1）。回归模型p=0.0007＜0.01达到极显著水平，说明该方程能够准确反映绿原酸提取量与各因素之间的关系。失拟项p=0.1249＞0.05，不显著，说明方程对实验拟合良好，实验误差小。相关系数R2= 0.9827，表明有98.27%的数据可以用此回归模型来解释。

2.2.2双因素交互分析由方差分析（表3）看出，本实验所建立的数据模型中X1X2（浸提时间与微波时间）、X1X3（浸提时间与乙醇浓度）的交互作用均达到极显著水平（p＜0.01），即它们的交互作用对玉米须绿原酸提取量有极显著影响，其交互作用响应面图如图6所示。

表2　Box-Behnken实验设计及结果Table 2　Box-Behnken experimental design and results for response surface analysis

表3 回归模型方差分析Table 3　Results of variance analysis using the regression model

图6　各因素交互作用对绿原酸提取量的影响Fig.6 Response surface for the effects of extraction time，microwave time，ethanol concentration on extraction rate of chlorogenic acid

由图6看出，微波时间相对于乙醇浓度、浸提时间的曲线较陡，等高线沿着微波时间轴变化相对密集，说明微波时间的影响较显著。微波时间固定时，乙醇浓度的曲线比浸提时间的陡峭，且等高线随着乙醇浓度值变化相对密集，说明乙醇浓度的影响比浸提时间的影响大，这与回归模型的方差分析结果一致。

2.2.3最佳提取工艺条件的确定通过软件分析，得出最优的提取工艺条件为浸提时间1.25h，微波时间27.03s，乙醇浓度70%，此时玉米须绿原酸提取量达到最大值8.98409mg/g。为检验结果的可靠性，考虑到实验操作的可行性，采用浸提时间1.25h，微波时间27s，乙醇浓度70%，在此条件下进行实验，得到玉米须绿原酸的实际提取量为8.94mg/g，与理论预测的误差为0.4%，说明响应面优化得到的提取工艺条件准确可靠，具有可行性。

3　结论

利用微波协同酶法提取玉米须中的绿原酸，具有提取条件温和，提取效率高，省时、节能等优点。在单因素实验的基础上，采用响应面法对微波-纤维素酶辅助提取玉米须绿原酸的工艺条件进行了优化，研究发现浸提温度、微波时间、乙醇浓度对绿原酸提取量影响均极显著（p＜0.01）；在因素交互作用中，只有微波时间与乙醇浓度的交互作用不显著。纤维素酶协同微波提取的最优工艺条件为微波功率240W、微波时间27s、纤维素酶添加量1.4%、浸提时间为1.25h、乙醇浓度70%，在此条件下玉米须绿原酸提取量为8.94mg/g。

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Optimization of microwave-assisted cellulase pretreatment extraction for chlorogenic acid from corn silk

GUAN Hai-ning1，2，QIAO Xiu-li1，2，DIAO Xiao-qin1，CHI Cai-xia1
（1.College of Food and Pharmaceutical Engineering，Suihua College，Suihua 152061，China；2.Key Laboratory of Food Analysis and Detection，Suihua College，Suihua 152061，China）

The optimum conditions for the extraction of chlorogenic acid from corn silk were determined using response surface methodology.On the basis of single-factor experiments，selecting microwave time，ethanol concentration and extraction time as independent variables，response surface methodology was applied to investigate the effect of three variables on extraction rate of chlorogenic acid.The optimal extraction conditions were obtained as follows:microwave power 240W，microwave time 27s，cellulase addition amount 1.4%，ethanol concentration 70%，and extraction time 1.25h.Under these conditions，the extraction rate of chlorogenic acid was up to 8.94mg/g.

corn silk；chlorogenic acid；cellulase；microwave；response surface methodology

TS210.1

A

1002-0306（2015）10-0198-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.032

2014－07－21

关海宁（1980-），男，硕士研究生，副教授，主要从事食品营养与分析检测及副产物综合利用方面的研究。

绥化学院2014年科学技术研究资助项目［K1401011］。