新疆野生苹果（Malus sieversii）的总多酚、总黄酮提取物的抗氧化活性研究

陈志娜，师俊玲，王继勋

（1.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西杨凌712100；2.西北工业大学生命科学学院，陕西西安710072；3.新疆农业科学院园艺作物研究所，新疆乌鲁木齐830091）

新疆野生苹果（Malus sieversii）的总多酚、总黄酮提取物的抗氧化活性研究

陈志娜1，师俊玲2，*，王继勋3

（1.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西杨凌712100；2.西北工业大学生命科学学院，陕西西安710072；3.新疆农业科学院园艺作物研究所，新疆乌鲁木齐830091）

以采集于新疆不同地区的20个野生苹果品种为研究对象，福林酚法测总多酚，分光光度计法测定总黄酮，DPPH、ABTS、还原能力法测定总抗氧化能力，相关系数法分析各个指标之间的相关性。结果显示，不同品种的野生苹果的总多酚、总黄酮及抗氧化活性之间具有显著差异，其中，HDM-23的总多酚含量最高（4714.33μmol没食子酸/100g鲜果），XY-31的总黄酮含量最高（2452.84mg芦丁/100g鲜果）。总多酚、总黄酮及抗氧化活性之间呈极显著（p＜0.01）正相关，表明总多酚与总黄酮是野生苹果抗氧化活性的主要贡献物质。

野生苹果（Malus sieversii），多酚，黄酮，抗氧化能力

野生苹果（Malus sieversii［Ledeb.］Roem.）是栽培苹果（Malus domestica Borkh）的起源，属于第三纪孑遗物种［1］。长期的自然选择使野生苹果的环境适应能力及抗病性更强，如抗苹果霉心病、抗吉丁虫等［2］。因此，野生苹果是抗逆苹果育种的重要来源，而新疆西部山区盛产多种野生苹果。

有研究表明，酚类化合物不仅与植物防御病原菌的机制有关（如Phytophthora sp.和Sclerotinia sclerotiorum），还有利于抵抗云杉食心虫及冷热刺激等［3-6］。另外，多酚化合物是水果中一种重要的抗氧化活性物质［7-8］。目前，野生苹果的遗传多样性已经被发现［9-11］。此外，野生苹果叶子中的多酚成分与抗氧化活性也有了初步研究［12］。然而，不同地区不同品种的野生苹果果实中的总多酚、总黄酮及其抗氧化活性的研究还鲜有报道。因此，本实验以新疆不同地区不同品种的野生苹果为研究对象，对基本理化指标、总多酚、总黄酮、抗氧化活性及其之间的相关性进行了研究，为其将来的应用提供基本的参考资料。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

二十种不同品种的野生苹果（Malus sieversii） 9月中旬采集于新疆不同的地区，洗净后-80℃下保存，样品的采集地点、园艺化学指标见表1；2，2’-联氨-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐［2，2’-Azinobis（3-ethylbenzenothiazoline-6-sulphonic acid），ABTS］、水溶性维生素E（6-hydroxy-2，5，7，8-teramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox）、福林酚、1，1-二苯-2-苦基肼（2，2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）均购于Sigma公司；没食子酸（gallic acid）、芦丁（rutin）均购买于上海融禾医药科技发展有限公司。

UVmini-1240紫外-可见分光光度计日本岛津公司；HC-3018R高速冷冻离心机安徽中科中佳科学仪器有限公司；KQ-700DE型数控超声清洗器昆山市超声仪器有限公司；BT25S电子天平赛多利科学仪器（北京）有限公司；DK-S26型电热恒温水浴锅上海森信实验仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1样品处理样品的提取方法参照Zhao和Hall［13］的方法略作修改。冷冻后的野生苹果切块，加入0.1%异VC，于研钵中充分研磨至均浆状，精确称取（2±0.005）g均浆于三角瓶中，加入100mL 80%（v/v）的乙醇，用塑料膜封口，超声波提取30min后抽滤，收集滤液进行测定。实验重复3次。

1.2.2基本化学指标可滴定酸的测定根据GB/ 12293-90；VC的测定参照GB/6195-1986；单宁的测定参照NY/T1600-2008；果胶的测定方法参照NY/T 2016-2011。

1.2.3野生苹果总多酚含量的测定样品中总多酚含量的测定采用福林酚法，参考Cai等［14］的方法，取0.8mL样液于小试管中，加入0.2mol/L福林酚试剂1.0mL，摇匀后静置反应5min，再加入7.5%（w/v）碳酸钠溶液0.8mL，摇匀后置于25℃水浴中反应30min，765nm处测定吸光值。空白作对照调零，以没食子酸为标准物质制作标准曲线（0～150μmol/L），结果换算成每克鲜果相对于没食子酸的量（μmol没食子酸/100g鲜果），实验重复3次。标准曲线方程为Y=0.005X+ 0.0254，R2=0.9992。

1.2.4野生苹果总黄酮含量的测定参考Sun等［15］的方法，略作修改。取5.0mL样液于试管中，加入0.3mL 5%（w/v）亚硝酸钠溶液，摇匀后静置反应5min，再加入0.3mL 10%（w/v）三氯化铝，摇匀后于25℃下水浴反应6min，再加入2mL 4%（w/v）氢氧化钠，摇均后静置反应10min，510nm下测定吸光值，空白作对照调零。以芦丁为标准物质制作标准曲线，结果换算成每克鲜果相当于芦丁的量（mg芦丁/100g鲜果），标准曲线方程为Y=0.0047X-0.0109，R2=0.9995。

表1　不同品种的野生苹果的采集地点与品性Table 1　Sampling sites and characteristics of the collected wild apple varieties

1.2.5ABTS+·清除能力的测定参考Tai等［16］的方法，取7mmol/L ABTS溶液5mL，加入140mmol/L过硫酸钾溶液88μL，室温下避光放置12～16h，使用前用无水乙醇调零，在734nm处用无水乙醇将其吸光值调整至0.700±0.05，作为工作液备用。

取ABTS+·工作液3mL于试管中，加入样液0.5mL，摇匀后置于25℃水浴避光反应30min，用无水乙醇调零，在734nm处测定吸光值。以水溶性维生素E（Trolox）为标准物质制作标准曲线，结果换算为每克鲜果相当于Trolox的量（μmol Trolox/100g鲜果），标准曲线方程为Y=-0.004X+0.545，R2=0.9999。

1.2.6DPPH·清除能力的测定参考Vieira等［17］的方法，取6.0×10-5mol/L DPPH无水乙醇溶液0.5mL，加入3mL样液，摇匀后置于25℃水浴避光反应30min，以蒸馏水调零，在517nm处测定吸光值。以Trolox为标准物质制作标准曲线，结果换算为每克鲜果相当于Trolox的量（μmol Trolox/100g鲜果），标准曲线方程为Y=-0.0195X+0.8108，R2=0.9994。

1.2.7还原能力的测定参考Tai等［16］的方法，略作修改。取1.0mL样液于试管中，加入0.2mol/L、pH6.6磷酸缓冲液2.5mL，再加入1.0%（w/v）铁氰化钾溶液2.5mL，摇匀置于25℃水浴反应20min后，迅速冷却，并加入10.0%（w/v）三氯乙酸溶液2.5mL，摇匀，5000×g离心，取上清液2.5mL于干净试管中，加入2.5mL蒸馏水，再加入0.5mL 0.1%三氯化铁溶液，摇均后静置10min，在710nm处测定吸光值。以抗坏血酸为标准物质制作标准曲线，结果换算为每克鲜果相当于抗坏血酸的量（mg抗坏血酸/100g鲜果），标准曲线方程为Y=0.0077X+0.0838，R2=0.9993。

1.3数据处理

结果用3次平行实验的平均值±标准差表示。使用SAS8.0软件，采用ANOVA进行显著性检验，选取p＜0.05为显著水平。

表2　不同品种的野生苹果的化学指标Table 2　Chemical characteristics of the collected wild apple varieties

2　结果与分析

2.1基本化学指标

20种野生苹果的基本化学指标见表2。糖酸比是反映苹果风味和感官特性的重要指标［18］，而实验中的野生苹果品种的糖酸比小于10，所以不适宜食用。Vieira等［19］曾经报道糖酸比小于20的苹果品种风味尖酸，适于后期加工或酿制苹果酒。

2.2总多酚与总黄酮的含量

苹果的品种、生长地不同以及不同的提取方法和抗氧化活性的测定方法都会影响其总多酚含量与抗氧化能力［19-22］。本实验首次对采样于中国新疆的不同品种的野生苹果的主要成分和抗氧化活性进行综合分析。

由图1可知，不同品种的野生苹果总多酚含量从（1419.33±178.98）μmol没食子酸/100g鲜果到（4714.33± 223.92）μmol没食子酸/100g鲜果，平均含量为2664.70μmol没食子酸/100g鲜果。其中HDM-23中的总多酚含量最高，其次是XY-49，XY-58中的总多酚含量最低。Henriquez等［19，21］研究了智利5种栽培苹果品种的总多酚含量，发现苹果果皮中的多酚含量明显高于果肉，其中蛇果品种的多酚含量最高，而实验中的新疆野生苹果总多酚的平均值是蛇果果皮中的3倍左右。据报道，植物的抗病性与其多酚含量有关，往往多酚含量越高抗病性越强［3-6］。因此，野生苹果中的多酚含量较高可能与其所处的恶劣环境有关，如病害、虫害、营养物质的缺乏等，这些刺激了多酚的积累［18］。

类黄酮是一类重要的酚类物质，因为其对人类健康的重要作用而引起广泛的关注［23］。由图2可以看出，不同品种的野生苹果总黄酮含量从（639.01±62.11）mg芦丁/100g鲜果到（2452.84±22.15）mg芦丁/ 100g鲜果，平均含量1093.25mg芦丁/100g鲜果。其中XY-31中的总黄酮含量最高，其次是HDM-23，XY-39中的总黄酮含量最低。Vieira等［17］对三种栽培苹果品种的总黄酮的研究表明，苹果果皮中的总黄酮的含量要明显高于果肉中的含量，而且，有研究表明果皮是苹果生物活性最高的部分［24-25］。Petkovsek等［26］认为这些差异主要是因为果皮中的黄酮苷与高含量的儿茶素与绿原酸。因此，在野生苹果的应用过程中，不能忽视对果皮的充分利用。

图2　不同品种的野生苹果中总黄酮的含量（n=3）Fig.2　Total flavonoid content of different wild apple varieties（n=3）

2.3抗氧化活性的测定

野生苹果的抗氧化能力分别换算成了Trolox当量（μmol Trolox/100g鲜果）与抗坏血酸当量（mg抗坏血酸/100g鲜果）。图3为不同品种野生苹果提取物对ABTS+自由基清除的能力，图4为不同品种野生苹果提取物对DPPH·自由基清除的能力。

由图3可知，不同品种的野生苹果提取物对ABTS+·和DPPH·的清除能力存在显著性差异。20种野生苹果提取物对ABTS+·的清除能力从1872.22到5654.17μmol Trolox/100g鲜果，对DPPH·的清除能力从782.82到1919.15μmol Trolox/100g鲜果，平均值分别为3326.60μmol Trolox/100g鲜果和1283.09μmol Trolox/100g鲜果。因此，实验中的野生苹果提取物对ABTS+·的清除能力要明显高于对DPPH·的清除能力。其中，XY-31、HDM-23和XY-49具有最强的清除ABTS+·和DPPH·的能力，XY-58清除ABTS+·的能力最弱，XY-16清除DPPH·的能力最弱。

图3　不同品种的野生苹果对ABTS+·自由基的清除能力（n=3）Fig.3　Antioxidant activity of twenty wild apple varieties measured by ABTS+·assay TEAC means Trolox equivalent antioxidant capacity（n=3）

图4　不同品种的野生苹果对DPPH·自由基的清除能力（n=3）Fig.4　Antioxidant activity of twenty wild apple varieties measured by DPPH·assay TEAC means Trolox equivalent antioxidant capacity（n=3）

由图5可知，不同品种野生苹果提取物对Fe3+到Fe2+的还原能力从145.78到1433.12mg抗坏血酸/100g鲜果。不同品种的野生苹果提取物对Fe3+到Fe2+的还原能力具有显著性差异，其中，XY-49对Fe3+到Fe2+的还原能力最高，XY-16对Fe3+到Fe2+的还原能力最弱，相差了近10倍。

2.4相关性分析

20种不同品种的野生苹果之间滴定酸、总糖、VC、单宁、果胶、可溶性固形物、总多酚、总黄酮及抗氧化活性之间的相关性见表3。由表3可知，总多酚、总黄酮、ABTS+·与DPPH·4个指标两两之间极显著（p＜0.01）正相关，而VC含量与ABTS+·与DPPH·之间没有显著相关性，表明总多酚与总黄酮是野生苹果抗氧化活性的主要贡献物质。总糖和总多酚含量与还原能力相关，而总黄酮的含量与还原能力不相关。因此，野生苹果提取物对Fe3+到Fe2+还原能力的主要贡献物质是总糖和总多酚。

表3　20种野生苹果的滴定酸、总糖、VC、单宁、果胶、可溶性固形物、总多酚、总黄酮及抗氧化活性之间的相关性Table3　Correlation coefficients of titratable acidity，total sugar，vitamin C，tannic，pectin，total soluble solid，total polyphenol，total flavonoid，ABTS assay，DPPH·assay and reducing power assay of wild apple species

图5　不同品种的野生苹果的还原能力（n=3）

3　结论

本实验研究了20种不同品种的野生苹果滴定酸、总糖、VC、单宁、果胶、可溶性固形物、总多酚、总黄酮及抗氧化活性，及其之间的相关性。发现不同品种的野生苹果的总多酚、总黄酮及抗氧化活性之间具有显著地差异，其中HDM-23中的总多酚含量最高，为4714.33μmol没食子酸/100g鲜果，明显高于普通栽培品种；XY-31中的总黄酮含量最高，为2452.84mg芦丁/100g鲜果。野生苹果品种的糖酸比普遍小于10，所以不适宜食用，适于后期加工或酿制苹果酒。

相关性分析显示总多酚与ABTS+·和DPPH·之间的相关性系数达到了0.87和0.83，总黄酮与ABTS+·和DPPH·之间的相关性系数都是0.92，极显著（p＜0.01）正相关，表明总多酚与总黄酮是野生苹果抗氧化活性的主要贡献物质。

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Antioxidant activity of polyphenolics and flavonoid extracted from wild apple（Malus sieversii）

CHEN Zhi-na1，SHI Jun-ling2，*，WANG Ji-xun3
（1．College of Food Science and Engineering，Northwest A&F University，Yangling 712100，China；2．School of Life Sciences，Northwestern Polytechnical University，Xi’an 710072，China；3．Institute of Horticulture，Xinjiang Academy of Agricultural Sciences，Urumqi 830091，China）

Twenty different lines of wild apple（Malus sieversii）collected from different places in Xinjiang，China were used as research objects.Total total polyphenol content was measured using the Folin-Ciocalteau method.Total flavonoid content was measured by spectrophotometer.Total antioxidant capacities were analyzed by ABTS assay，DPPH assay，and iron（Ⅲ）to iron（Ⅱ）reducing power assay，and the correlation between the various indicators was measured with Pearson correlation coefficient.It was found that HDM-23 had the highest total polyphenol content（4714.33μmol gallic acid/100g fresh matter），and XY-31contained the highest amount of total flavonoid content（2452.84mg rutin/100g fresh matter）.The present study implied that total polyphenols contribute to the antioxidant properties of the wild apple（p＜0.01）and total flavonoid was an important phenolic compound in the wild apple varieties investigated.

wild apple（Malus sieversii）；polyphenol；flavonoid；antioxidant capacity

TS201.1

A

1002-0306（2015）10-0143-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.021

2014－07－21

陈志娜（1988-），女，博士，研究方向：食品生物技术。

师俊玲（1972-），女，教授，研究方向：生物技术。

公益性行业（农业）研究专项（201003021）。