恒古骨伤愈合剂促进腰椎板开窗术后微小骨粒回植骨重建的实验研究

陈振南　周忠　王万明　黄少斌　郭剑　徐志成

1.福建中医药大学附属漳州中医院骨伤科，福建漳州363000；2.南京军区福州总医院骨二科，福建福州350025；3.福建中医药大学骨伤学院，福建福州350108

恒古骨伤愈合剂促进腰椎板开窗术后微小骨粒回植骨重建的实验研究

陈振南1周忠2王万明2黄少斌2郭剑3徐志成3

1.福建中医药大学附属漳州中医院骨伤科，福建漳州363000；2.南京军区福州总医院骨二科，福建福州350025；3.福建中医药大学骨伤学院，福建福州350108

目的探讨恒古骨伤愈合剂促进兔腰椎板开窗处自体微小骨粒骨重建的疗效及作用机制。方法选取清洁级健康雄性新西兰大白兔22只，随机分为3组，治疗组（n=9）、对照组（n=9）、正常组（n=4）。治疗组建立兔腰椎板开窗术后微小骨粒回植的模型，给予恒古骨伤愈合剂治疗（按经由人与兔体表面积用药量换算计算出的剂量，兔用药量为1.30 mL/kg），灌胃，1次/2 d，服用3个月；对照组建立模型后，服用相同剂量的生理盐水，正常组未进行手术处理，相同剂量的生理盐水灌服，治疗后4、8、12周分别行大体标本粘连组织观察、羟脯氨酸（Hyp）测定、CT检查及组织形态学观察。结果大体观察及组织学发现，治疗组的粘连程度Rydell分级及组织学分级要远低于对照组（P＜0.05）。羟脯氨酸浓度分析结果显示治疗组瘢痕组织中羟脯氨酸浓度要明显低于对照组（P＜0.05）。CT检查示术后12周治疗组微小骨粒形成骨板与开窗椎板骨质相连、骨梁连续，无明显界限，椎管形态及容积无明显变化，未见脊髓受压；对照组对照节段椎板缺损，少量瘢痕突入椎管内，椎管重建未完成。结论恒古骨伤愈合剂可有效促进兔椎板开窗处再植自体微小骨粒的骨重建，形成的骨板可遮挡瘢痕侵入椎管，减少椎管内粘连。

恒古骨伤愈合剂；椎板开窗术；回植；骨重建

经椎板开窗髓核摘除术曾被认为是腰椎间盘突出症（lumbar disc herniation，LDH）手术的标准术式，尽管其在充分减压情况下，最大程度保护椎板的完整性，但仍引起椎管内粘连等并发症。将腰椎椎板开窗术中要废弃的椎板微小骨粒，通过适当干预促进其在骨窗处的骨重建形成骨性骨板遮挡硬膜外粘连是本课题的研究重点。恒古骨伤愈合剂作为促进骨折愈合的口服制剂，在四肢骨折愈合及减轻股骨头坏死上疗效显著。然而在脊柱骨重建方面未见报道，本研究通过建立兔椎板开窗术后微小骨粒回植模型的实验研究，探讨恒古骨伤愈合剂对微小骨粒回植于椎板开窗处骨重建的疗效及作用机制，为临床提供实验依据。

1　材料与方法

1.1材料与动物

1.1.1药物与试剂恒古骨伤愈合剂（规格：25 mL/瓶，云南克雷斯天然药物制药厂；生产批号：Z20025103），医用胶原蛋白海绵［无锡贝迪生物工程有限公司；国食药监（准）字：2006第3640727号］，羟脯氨酸含量测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.1.2实验动物3月龄清洁级健康雄性新西兰大白兔22只，体重2.2～2.5 kg［购自上海市松花江区松联实验动物饲养场；合格证号：SYXK（沪）2012—0011］。所有动物按照标准进行管理，采用标准饲料喂养，造模于南京军区福州总医院比较医学科动物实验室，实验后处置兔子符合伦理学标准。

1.2方法

1.2.1实验分组清洁级健康雄性新西兰大白兔22只，随机分为3组，治疗组（n=9）、对照组（n=9）、正常组（n=4）。治疗组：建立兔椎板开窗术后微小骨粒回植的模型，给予恒古骨伤愈合剂治疗，1次/2 d，服用3个月；对照组：建立模型后，服用相同剂量的生理盐水；正常组：未进行手术处理，相同剂量的生理盐水灌服。

1.2.2动物造模新西兰大白兔术前腰背部术野备皮，范围在12 cm×20 cm左右，实验动物用3%戊巴比妥钠（30 mg/kg）耳缘静脉注射全麻，并术前半小时常规给予头孢唑林钠（50 mg/kg）肌内注射，预防感染。将兔子俯卧并置于特制的固定架上，手术野去毛，记号笔定位L5、L6，用碘伏消毒后，进行铺巾，以L5棘突为中心，切开皮肤及筋膜约2 cm，锐性分离骶棘肌，充分显露左侧L5椎板，暴露出L5椎板“卵圆形”的小口，用微型小枪钳慢慢咬去椎板、黄韧带，然后沿着椎板边沿向上咬开椎板，进行开窗术，暴露约0.8 cm×0.3 cm大小骨窗，将开窗咬下的碎骨粒剪碎，然后将碎骨粒镶嵌于医用胶原蛋白海绵，塑成拱桥形，放置于硬膜外开窗处，缝合切口，术后用碘伏消毒切口，回笼饲养。

1.3观察指标

1.3.1大体标本粘连性状观察观察各组椎板开窗位置周围组织与硬脊膜的关系及瘢痕生成情况。大体粘连情况评分系统采用Rydell标准［1］，由两位经验丰富的病理科医师盲法、独立对实验节段大体粘连分级进行评估，综合结果。

1.3.2羟脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）测定切取椎板开窗位置水平相应部位硬脊膜背侧大小为1 cm×1 cm×1 cm硬膜外组织，将其漂洗干净，吸干水分后称重100 mg放入试管中，剪碎，准确加入水解液1 mL，混匀。羟脯氨酸含量测定过程严格按南京建成生工试剂盒说明书操作。

1.3.3影像学检查术后各组于在术后4、8、12周进行手术区域脊柱标本CT扫描，同时进行椎管矢状径测量。由两位经验丰富的影像科技师盲法、独立对兔腰椎实验节段矢状径大小进行测量，综合结果。

1.3.4组织学观察进行大体观察后，切取兔腰5椎体节段连同硬膜外组织标本，用中性福尔马林固定2 d，用10%硝酸脱钙48 h，然后进行标本脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色，每段横切片4张，厚约3 mm，行HE染色，普通光镜观察瘢痕组织在硬膜外的分布及粘连的程度，评级标准参考文献［2］，同时观察微小骨粒骨重建情况。

1.4统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件对数据处理分析，Rydell分级及组织学分级比较采用非参数秩和检验，矢状径及羟脯氨酸测定数据采用均值±标准差（x±s）表示。方差齐性时，组别及时间整体分析采用两因素重复测量方差分析，组内时间影响整体分析采用单因素方差分析，各时间点两两比较采用差值t检验，方差未齐性时，考虑非参数秩和检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1粘连组织观察

对兔腰5椎体手术节段取材，采用大体观察及光镜观察硬脊膜与硬膜外瘢痕组织的粘连情况，由福州总院病理科协助盲法肉眼观察。治疗组与对照组术后Rydell分级、组织学分级，与正常组比较，差异有统计学意义（P＜0.01），表明腰椎开窗手术硬膜外粘连加重，造模成功。治疗组与对照组两组术后Rydell分级、组织学分级比较差异有统计学意义（P＜0.05），表明治疗组服用恒古骨伤愈合剂可有效减轻瘢痕形成及硬膜外粘连程度。见表1。

表1　三组兔椎板硬膜外粘连组织Rydell分级及组织学分级（只）

2.2羟脯氨酸的测定

治疗组与对照组新西兰大白兔的羟脯氨酸（Hyp）含量比较，术后4、8、12周两组间Hyp含量比较，治疗组硬膜外粘连程度明显较对照组减轻（P＜0.05）。见表2。

表2　硬膜外瘢痕组织中Hyp的含量比较（μg/mg，x±s）

2.3影像学比较

2.3.1椎管矢状径比较治疗组与对照组椎管矢状径大小比较，术后4周两组间矢状径大小比较差异无统计学意义（P＞0.05），术后8、12周两组间矢状径比较，治疗组椎管矢状径较对照组增宽（P＜0.05）。见表3。

表3　两组实验节段不同时间段椎管矢状径的变化（mm，x±s）

2.3.2微小骨粒回植区CT表现术后4、8、12周CT显示治疗组实验节段微小骨粒位置保持良好，开窗处碎骨粒愈合良好，形成骨性挡板，椎管形态及容积无变化；对照组对照节段开窗位置微小骨粒逐渐部分吸收，可见局部缺损，椎管外瘢痕少量侵入椎管内压迫脊髓，椎管未完成重建。见图1。

2.3.3回植区粘连组织及骨组织学观察术后4周，可见治疗组硬脊膜与瘢痕组织因微小骨粒的遮挡有明显的界限，可见少量成纤维细胞及脂肪组织充满间隙，同时见大量新生的编织骨；对照组硬脊膜与瘢痕组织粘连也不明显，硬膜囊无变形，间隙有较多的成纤维细胞；术后8周，治疗组硬脊膜与瘢痕组织之间仍稍有间隙，成纤维细胞与纤维细胞混杂，数量中等（图2a）；对照组瘢痕组织与硬膜部分区域粘连紧密，硬膜囊受压稍变形（图2b）；正常组椎板外肌肉正常（图2c）。治疗组微小骨粒之间连接紧密，微小骨粒与椎板咬除缘之间有多量新生骨小梁生成，形成完整的骨板，结构较薄（图2d）；对照组椎板开窗位置微小骨粒直接连接较少，且有局部吸收现象，周围掺杂纤维组织（图2e）；而正常组椎板结构正常，可见正常的骨陷窝及骨小梁（图2f）。术后12周治疗组瘢痕组织与硬膜部分被形成的骨板遮挡，周围成纤维细胞与纤维细胞数量中等，硬膜囊未受压变形，微小骨粒形成的骨板逐渐增厚。对照组瘢痕组织与硬膜部分区域粘连紧密，并沿开窗位置向椎管内延伸，程度不等。椎板再生缓慢，微小骨粒部分残留，一侧与开窗部位的骨板连接，但是另一侧游离，形成不完整的椎板，周围与纤维组织包绕，少量瘢痕组织长入椎管，椎管稍狭窄。

图1　治疗组与对照组在术后4、8、12周CT扫描结果

图2　各组8周后椎板开窗位置肌肉组织及骨组织镜下观察情况（HE，100×）

3　讨论

3.1椎板开窗术微小骨粒回植预防硬膜外粘连理论基础

参照已报道的椎板切除术预防硬膜外粘连的研究中，绝大部分是以全椎板切除为模型，应用较多的是采用膜性材料（自体或人工）阻隔硬脊膜和瘢痕组织的空隙或者依据“三维立体学说”辅助半流体物质包绕神经根，主要作用在于硬膜后方设置屏障阻挡来自后方粘连组织压迫与侵入，从而减轻硬膜外粘连程度。在置于硬膜外表面的生物性和非生物性惰性材料中主要包括人体筋膜、皮肤、脂肪颗粒、纤维蛋白凝胶、膨体聚四氟乙烯、ADCONL、聚乙交酯、几丁糖、人工骨等，此外中医药制剂也在运用，如丹参透明质酸凝胶混合物、当归注射液等，但每种材料均存在各自不足。研究发现自体骨回植不仅经济，而且效果满意［3-9］。

本实验根据自体微小颗粒骨的成骨是以众多颗粒骨为中心的多点同时成骨，即骨传导作用成骨，骨生成作用成骨，骨诱导作用成骨，因此成骨较快。依托医用胶原蛋白海绵的良好支架作用，并经过一段时间可生物降解，有利于微小骨粒的成骨；另外椎板切除后本身还具有一定再生作用，因此通过微小骨粒回植在椎板开窗处较小的缺损区域，能达到骨重建，重新形成硬脊膜后方骨性屏障，遮挡粘连。治疗组与对照组术后4周两组间矢状径大小比较差异无统计学意义（P＞0.05），术后8、12周两组间矢状径比较差异有统计学意义（P＜0.05），治疗组椎管矢状径较对照组增宽，即治疗组术后8、12周的矢状径分别为（6.17± 0.13）、（6.16±0.05）mm，均较正常组［（6.01±0.06）mm］大，表明治疗组术后未造成椎管狭窄，对马尾神经没有急性压迫和损害。因此在腰椎开窗位置进行微小骨粒回植不仅有利于骨重建，而且不会造成椎管内狭窄，操作安全、简单。

3.2恒古骨伤愈合剂在预防硬膜外粘连中的疗效评估

硬膜外瘢痕形成尽管作为正常组织的修复过程，但是其粘连程度及粘连位置对于腰椎术后疗效评估影响很大，甚至可以造成医源性椎管狭窄，包绕神经根或硬脊膜导致神经的正常电生理过程发生障碍，因此硬膜外瘢痕的形成是术后症状无改善及手术失败的重要原因。本实验的组织学观察表明，通过Rydell分级、组织学观察表明，A、B两组术后Rydell分级、组织学分级，与正常组比较，差异有高度统计学意义（P＜0.01），表明腰椎开窗手术硬膜外粘连加重，造模成功。A、B两组术后Rydell分级、组织学分级比较差异有高度统计学意义（P＜0.01），表明治疗组服用恒古骨伤愈合剂可有效减轻瘢痕和硬膜粘连的紧密程度。

实验中羟脯氨酸测量作为衡量瘢痕胶原组织含量的重要指标，主要基于羟脯氨酸在胶原氨基酸总量的比重，其约占胶原氨基酸总量的13.4%，排除弹性蛋白含少量羟脯氨酸外，其余均不含羟脯氨酸。因此可把瘢痕组织中羟脯氨酸含量测定进行粘连程度的比较。治疗组与对照组术后4、8、12周的Hyp含量比较，治疗组硬膜外粘连Hyp含量明显较对照组低（P＜0.05）。通过组织学观察和生化测量发现治疗组服用恒古骨伤愈合剂后其硬膜外粘连组织中胶原含量减少并且瘢痕结构相对疏松，可能通过抑制瘢痕组织中成纤维细胞的增殖，达到减轻瘢痕的过程。

尽管实验发现恒古骨伤愈合剂在防止粘连上有一定的作用，但其作用机制目前仍不明确，是恒古骨伤愈合剂的直接作用导致硬膜外粘连组织的形成受到有效抑制，还是通过碎骨粒形成的骨板而发挥作用，抑或是两者联合作用，在实验和临床上还需要进一步探索。

3.3恒古骨伤愈合剂在微小骨粒重建的作用

中医在骨重建方面认为是一个“瘀去、新生、骨合”的过程，因此早期活血化瘀，中期接骨续筋，后期补肝肾是伤科三期辨证体系的表现。恒古骨伤愈合剂由红花、三七、杜仲、人参、黄芪等配制而成，在益气活血过程中兼顾补肝肾、强筋骨等扶正治法，实验中治疗组服用恒古骨伤愈合剂后4～12周微小骨粒形成的骨板逐渐增厚，骨密度增高，与对照组比较差异有统计学意义。现代药理研究表明红花作为铜、锌的含量较高的活血药，不仅可以促进骨折部位血管组织的修复，而且加强铜、锌元素参与骨折修复过程，提高骨折的愈合率［10］。三七因其有效的活血功能，在微循环中发挥积极作用，可以有效降低全血黏度，不仅利于药物的吸收，同时加速血肿机化与纤维化，缩短骨痂形成时间［11］。刘豫蓉等［12］通过体外实验评估黄芪作用中发现，成骨细胞在适宜浓度的黄芪多糖水溶液中可以再生活跃，而且在短期内取得明显的效果。研究表明杜仲提取的总黄酮在分子水平上刺激骨髓间充质干细胞向成骨方向转化，能明显促进成骨细胞的增殖、分化，促进骨折的愈合。因此恒古骨伤愈合剂不管从中医角度，还是现代药理学研究都表明了其在骨折愈合率、骨折愈合时间上有明显优势［13-17］。

恒古骨伤愈合剂促进微小骨粒骨重建作用机制，可能如下：①活血化瘀方面疗效显著，可有效改善局部微循环，促进椎板开窗缺损处血肿机化，形成纤维骨痂。②调节钙盐在微小骨粒的沉积率，缩短骨痂形成时间并提高骨痂质量。③调节骨生长因子，促进骨形态发生蛋白合成。

［1］Yang J，Ni B，Liu J，et al.Application of liposome-encapsulated hydroycamptothecin in the prevention of epidural scar formation in New Zealand white rabbits［J］.Spine J，2011，11（3）：218-223.

［2］HeY，RevelM，LotyB.Aquantitativemodelofpost-laminectomy scar formation and effects of a non-steroidal anti-inflammatory drug［J］.Spine，1995，20（5）：557-563.

［3］陈立科，李康华，曹盛俊.几丁糖与人工骨联合应用预防椎板切除术后硬膜外粘连的实验研究［J］.中国脊柱脊髓杂志，2005，15（4）：239-241.［4］唐文胜，蒋电明，安洪，等.纳米羟基磷灰石/聚酰胺复合人工椎板预防脊柱后路术后椎管内瘢痕粘连的实验研究［J］.中国脊柱脊髓杂志，2005，15（11）：675-678.

［5］唐欣，杨述华，李宝兴，等.同种异体骨板覆盖预防硬膜外瘢痕粘连的实验研究［J］.中国修复重建外科杂志，2006，20（8）：816-819.

［6］肖智博，吕富荣，吕发金，等.纳米羟基磷灰石/聚酰胺复合材料预防椎板切除后椎管狭窄粘连的初步影像研究［J］.重庆医科大学学报，2006，31（4）：489-493.

［7］沈洪涛，闰景龙.自体微小颗粒骨复合几丁糖修复椎板缺损的有限元分析［J］.中国组织工程研究与临床康复，2010，14（39）：7238-7242.

［8］张晨阳，张岩，梁文锴.丹参透明质酸凝胶混合物预防兔椎板切除术后硬膜外粘连的实验研究［J］.解放军医药杂志，2013，25（3）：15-18.

［9］杨利学，邵松涛，王官林，等.当归注射液预防椎板切除术后硬膜外粘连的实验研究［J］.中国中医骨伤科杂志，2013，21（4）：4-7.

［10］赵晓莲，翟饶生，李晶，等.红花对家兔实验性骨折愈合中锌铜含量的影响［J］.黑龙江医药科学，2004，27（2）：43-44.

［11］杨军，任婷，李学东，等.三七总皂甙促进骨折愈合作用的实验研究［J］.医学研究杂志，2010，39（6）：69-71.

［12］刘豫蓉，张朝良，孔祥丽，等.黄芪多糖对成骨细胞增殖分化和结构的影响［J］.国际口腔医学杂志，2010，37（2）：133-137.

［13］李三华，何志全，陈全利，等.杜仲总黄酮对成骨细胞增殖及Ⅰ型胶原蛋白表达的影响［J］.西北药学杂志，2011，26（4）：272-274.

［14］曾建春，樊粤光，刘建仁，等.杜仲含药血清诱导骨髓间充质干细胞定向分化的实验研究［J］.时珍国医国药，2009，20（9）：2136-2138.

［15］魏国俊，丁玉芬，侯费祎.中药杜仲含药血清对成骨细胞增殖成骨性的影响［J］.西部中医药，2013，26（3）：16-19.

［16］陈影，梁妹，申银艳.品管圈活动在提高骨伤患者功能锻炼依从性中的作用［J］.护理实践与研究，2014，11（11）：153-155.

［17］蒋雪飞，欧会芝.三结合康复护理模式在前交叉韧带重建术后患者中的应用［J］.护理实践与研究，2014，11（9）：147-148.

Experimental study of Osteoking on bone reconstruction after lumbar laminectomy and bone grains replantation surgery

CHEN Zhennan1ZHOU Zhong2WANG Wanming2HUANG Shaobin2GUO Jian3XU Zhicheng3
1.Department of Orthopedics，Zhangzhou Hosptial of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fujian Province，Zhangzhou363000，China；2.Second Department of Orthopedics，Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Region，Fujian Province，Fuzhou350025，China；3.School of Osteopathy，Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fujian Province，Fuzhou350108，China

Objective To explore the therapeutic effect and mechanism of Osteoking on bone reconstruction by observing the experimental research of Osteoking on bone reconstruction after lumbar laminectomy and bone grains replantation surgery in rabbits.Methods 22 healthy male New Zealand rabbits were selected and randomly divided into 3 groups，treatment group（n=9），model group（n=9）and normal group（n=4）.Treatment group and model group were performed with lumbar laminectomy and bone grains replantation surgery.Osteoking was offered to treatment group and normal saline（NS）at the same dose was offered to model group after modeling（according to the surface area of human to rabbits，the rabbits were treated with 1.30 mL/kg，1 time/2 d，3 months）.No surgery procedure was offered to normal group but same dose of NS.Observation of adhered tissue and morphological changes，determination of hydroxyproline（Hyp）as well as CT scan were performed after 4，8 and 12 weeks'treatment.Results Though the gross observation and histological observation，the results of treatment group which Rydell and organization classification were far lower than those of model group（P＜0.05）.Expression of Hyp showed that the treatment group had the lower epidural adhesion compared with the normal group（P＜0.05）.After 12 weeks of surgery，CT examination showed the bone plate which formed by bone grain in treatment group was connected with the vertebral bone，which canal morphology and volume had no obvious change，and no spinal cord compression；model group showed segment lamina defect which a small scar protruded into the spinal canal，and the vertebral canal reconstruction was not complete.Conclusion Osteoking can effectively promote bone reconstruction in the lamina of rabbits，and the bone plate can prevent scar from expanding into the spinal canal，and can reduce the intraspinal conglutination.

Osteoking；Laminectomy；Replantation；Bone reconstruction

R274.9

A

1673-7210（2015）12（b）-0012-05

2015-08-26本文编辑：赵鲁枫）

福建省科技厅重点项目（2012Y5005）。

周忠（1968.6-），副教授，硕士生导师；研究方向：脊柱与四肢。