人离体红细胞ATP含量与死亡时间和环境温度的关系

韩玮　于明鑫　唐晖　李常兰　贺敏　任素萍　焦章平　于群

1.北京市公安局丰台分局物证鉴定所，北京100072；2.北京十一学校，北京100850；3.北京市公安局法医检验鉴定中心，北京100192；4.军事医学科学院野战输血研究所，北京100850

人离体红细胞ATP含量与死亡时间和环境温度的关系

韩玮1，4▲于明鑫2▲唐晖3李常兰4贺敏4任素萍4焦章平3于群4

1.北京市公安局丰台分局物证鉴定所，北京100072；2.北京十一学校，北京100850；3.北京市公安局法医检验鉴定中心，北京100192；4.军事医学科学院野战输血研究所，北京100850

目的研究通过红细胞ATP含量推断早期死亡时间的适用温度范围和时间范围。方法采集12名健康捐血者全血各40 mL，分装后分别保存于15、20、25、30℃的恒温箱中，以4 h间隔取血样，采用生物发光法检测ATP含量，各组进行统计学分析，推导线性回归方程，计算各时间点的偏离时间。结果4组平均偏离时间差距较大，15、20、25、30℃组平均偏离时间分别为4.80、2.04、1.77、5.71 h，而30℃组随着统计时间段的缩短平均偏离时间从5.71 h缩短至1.67 h。结论红细胞ATP含量这一参数最佳适用温度范围为20～30℃，有效评估时间20℃为64 h，25℃为40 h，30℃为28 h。

死亡时间；红细胞ATP含量；环境温度

死亡时间推断（estimation of the time since death）在刑事案件的侦破工作中具有非常重要的意义，在一定的温度范围内，红细胞ATP含量与保存时间具有直线相关性，可以作为死亡时间推断的一种客观参数［1］，常用死后间隔时间（postmortem intervals，PMI）来表达死亡时间［2］。本研究通过在不同温度下缩短红细胞ATP检测时间间隔（4 h），分析离体红细胞中ATP含量变化与PMI和环境温度之间的关系，以评估测定红细胞ATP含量用于推断早期死亡时间的有效时间范围和温度范围。

1　材料与方法

1.1材料

选取健康捐血者12名，均来自北京市公安局丰台分局，男、女各6名，无血液疾病或代谢性疾病，年龄25～40岁，采血前均告知采血量、可能风险并签订捐血志愿书。严格依照无菌操作规程，2010年3月由执业护士用EDTA真空采血管各采集全血40 mL。

1.2方法

1.2.1血样分组及保存将全血摇匀后，即刻将各个血样以每份500 μL分装到EP管中，而后分成4组，分别置于15、20、25、30℃的恒温箱中保存。各组样本分别在0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48 h时间点取1份待检，其中15、20℃组样本增加52、56、60、64、68、72 h时间点。

1.2.2血红蛋白含量测定将血样摇匀，然后将EP管放入Sysmex-Poch-100i血液分析仪（Sysmex公司，日本）样品槽中，测定血红蛋白浓度（g/L）并记录。

1.2.3红细胞ATP待检标本处理取40 μL血样加入装有1000 μL等渗PBS缓冲液的EP管中，摇匀，置于干热器中100℃加热10 min，自然冷却后13 000 r/min离心3 min，取上清液即为ATP待检标本。

1.2.4 ATP含量测定采用改良后生物发光法［3］。荧光素酶系缓冲液用50 mL蒸馏水溶解，标准ATP加1 mL荧光素酶系缓冲液溶解成50 μmol/L，用荧光素酶系缓冲液将荧光素-荧光素酶粉剂配成浓度3 g/L；取0.2 mL待测ATP样品于反应杯中，放入WDD-1型发光光度计（北京第二光学仪器厂）的反应暗室中，注入0.8 mL荧光素酶液，记录1 s积分最大发光强度；取ATP标准液从1∶2～1∶128倍比稀释，同样方法测定最大发光强度后绘制标准曲线，从标准曲线上查出样品ATP浓度值（μmol/L）。全部试剂为中国科学院上海植物生理研究所生产。

1.2.5红细胞ATP含量计算红细胞ATP含量（μmol/ gHb）=26×样本ATP浓度值/血红蛋白浓度值。

1.3统计学方法

数据采用SAS 9.2软件进行统计学分析。对不同温度组红细胞ATP含量（［ATP］）随保存时间（PMI）的变化进行线性回归分析，推导回归方程，并对相关系数进行相关性检验。根据不同温度组的回归方程进行各时间点残差计算。30℃组另选取0～24、28、32、36、40、44 h计6个时间段进行线性回归分析，并分别计算残差。以环境温度和保存时间为自变量，将不同温度组、不同保存时间下全部数据汇总采用最小二乘法进行曲线拟合，拟合形式分别为二元一次方程、二元二次方程和二元三次方程，并对拟合结果进行AIC检验，AIC值越小适合度越高。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1红细胞ATP含量随保存时间的变化

红细胞ATP含量随保存时间的变化见表1，其变化趋势见图1。红细胞ATP含量随保存时间的延长呈下降趋势。

2.2不同温度组线性回归分析及决定系数情况

不同温度组线性回归分析及决定系数（r2）情况见表2、3。各组r2差距较大，15、20、25、30℃组分别为0.961、0.988、0.994、0.936，30℃组不同时间段进行统计，r2值随时间段的缩短而增大，0～24 h段为0.991。相关分析显示，红细胞ATP含量与保存时间呈负相关（r均为负值），各组相关分析结果显示，ATP含量与保存时间的相关性差异有高度统计学意义（P＜0.01）。

表1　不同温度下红细胞ATP含量随保存时间的变化（μmol/gHb，n=12，

表1　不同温度下红细胞ATP含量随保存时间的变化（μmol/gHb，n=12，

注：“-”表示无数据

保存时间（h）15℃20℃25℃30℃0481 2 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 2.89±0.24 2.80±0.25 2.70±0.29 2.58±0.25 2.51±0.24 2.47±0.20 2.38±0.20 2.32±0.19 2.22±0.17 2.09±0.20 1.97±0.18 1.86±0.19 1.74±0.15 1.61±0.16 1.36±0.14 1.21±0.11 1.00±0.09 0.70±0.06 0.65±0.06 2.89±0.24 2.59±0.23 2.41±0.21 2.27±0.19 2.13±0.18 2.01±0.18 1.90±0.15 1.84±0.14 1.71±0.17 1.58±0.14 1.45±0.12 1.31±0.13 1.17±0.12 1.00±0.10 0.86±0.07 0.75±0.08 0.52±0.05 0.40±0.05 0.35±0.04 2.89±0.24 2.52±0.23 2.23±0.20 2.12±0.21 1.84±0.16 1.63±0.17 1.37±0.11 1.05±0.10 0.90±0.08 0.72±0.06 0.57±0.05 0.37±0.04 0.30±0.03 2.89±0.24 2.50±0.23 2.15±0.20 1.89±0.14 1.38±0.10 1.03±0.07 0.87±0.06 0.61±0.05 0.51±0.02 0.35±0.02 0.22±0.03 0.13±0.01 0.11±0.02 ------------

图1　不同温度下红细胞ATP含量随保存时间的变化

表2　不同温度条件下红细胞ATP含量与保存时间的线性回归分析

表3　30℃组不同时间段红细胞ATP含量与保存时间的线性回归分析

2.3不同温度组偏离时间分析

不同温度组偏离时间情况见表4、5。以各指标原始数据分别代入线性回归方程，计算残差（估计保存时间与实际保存时间之差），同一时间点上12个残差绝对值的均值为各时间点推测的平均偏离时间。表4、5结果显示，各组平均偏离时间亦差距较大，15、20、25、30℃组总体平均值分别为4.80、2.04、1.77、5.71 h，而30℃组随着统计时间段的缩短总体平均值从5.71 h缩短至1.67 h。

表4　不同温度下平均偏离时间的比较（h）

表5　30℃组不同时间段平均偏离时间的比较（h）

2.4红细胞ATP含量与保存时间和保存温度关系的拟合方程

红细胞ATP含量与保存时间和保存温度关系的拟合方程显示，二元三次方程的AIC值最小。见表6。

3　讨论

死亡时间常通过死后尸体现象、体液化学变化、直肠温度、昆虫学原理等方法进行分析推断［4-6］。随着DNA技术的发展，一些研究尝试利用DNA降解和蛋白质降解规律推断死亡时间［7-15］，但迄今为止，仍没有一种方法已在法医学实践中得到广泛应用。

表6　红细胞ATP含量与保存时间和保存温度关系的拟合方程

学者们很早就发现环境温度对死亡时间推断的明显影响［16-20］，玻璃体液钾离子浓度与死亡时间关系的研究，是近半个世纪以来法医病理学者们一直研究的热点。学者们选用不同的检测方法和实验对象，用所得实验数据建立了各自的死亡时间与玻璃体液钾离子浓度变化的回归方程。但由于各自研究中的影响因素有差异，造成了直线回归方程斜率和截距的不同。学者们提出用玻璃体液钾离子浓度推断死亡时间，应考虑尸温因素。研究发现，在环境温度为26～29℃时的回归方程的直线斜率，要比环境温度为13～17℃时的回归方程的直线斜率大［16-20］。这就说明了环境温度对玻璃体液中钾离子浓度变化的影响。环境温度越高，死后玻璃体液中钾离子浓度上升的速度越快。

利用血液体外保存测定红细胞ATP含量变化，证实红细胞ATP含量的下降在一定温度范围内与保存时间线性相关，说明利用红细胞ATP这一参数推断PMI具有较好的应用情景；但同时也发现环境温度对红细胞ATP含量变化有较大影响，因此应进一步探讨和建立环境温度等对红细胞ATP含量变化的影响模型［1］。张艳苓等［21］曾探讨人离体肝组织胺类产生与死亡时间和环境温度的关系。

至于如何判断某回归方程的应用价值，龚志强等［22］认为r2＞0.9的离子，其方程可用于PMI的推断。但是刘茜等［23］认为评价方程不应仅考虑r2的值，还应该注意评价方程在推断PMI时产生的预测偏离时间。笔者较为认同刘茜等［23］的观点，根据法医办案经验，对死亡时间推断其误差应控制在2 h左右为佳，否则其实际应用意义将大打折扣。

实验结果显示，红细胞ATP含量变化具有与死亡时间直线相关性，且相关性差异有统计学意义，因而这一参数可以用于死亡时间的推断。r2从高到低依次为25℃、20℃、15℃和30℃组，但30℃组缩短时间决定系数明显升高，笔者分析，30℃下红细胞ATP下降过快，较快进入极低水平（平台期），因此其适用范围应在进入平台期之前。而在较低温度（15℃组）下ATP下降速度过于缓慢，在此情况下检测相对误差较大，很难保证结果的准确性。

以AIC值最小为标准，Z=2.689-0.009X-0.00006Y2X为最佳拟合方程（其中Z为红细胞ATP含量，X为保存时间，Y为保存温度）。该方程提示，红细胞ATP含量与保存时间呈线性关系，而与保存温度呈指数关系。当然，上述拟合方程还较为粗糙，不够精细，通过进一步缩短检验间隔时间及拟合层次，将可以推倒出更为精确的拟合方程。

综上所述，以偏离时间2 h左右为标准，根据表4、5的实验结果，笔者认为，红细胞ATP含量这一参数最佳适用温度范围为20～30℃，有效评估时间20℃为64 h，25℃为40 h，30℃为28 h，30℃以上进一步缩短，而15℃以下预测平均偏离时间较大，不宜采用此参数。

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Correlation of ATP content in RBCs with both postmortem intervals and temperature of surroundings

HAN Wei1，4▲YU Mingxin2▲TANG Hui3LI Changlan4HE Min4REN Suping4JIAO Zhangping3YU Qun4
1.Forensic Science Identification Institute，Fengtai Sub-Bureau of Beijing Municipal Public Security Bureau，Beijing 100072，China；2.Beijing National Day School，Beijing100850，China；3.Forensic Inspection Appraisal Center，Beijing Municipal Public Security Bureau，Beijing100192，China；4.Institute of Field Operations Blood Transfusion，A-cademy of Military Medical Sciences，Beijing100850，China

Objective To estimate suitable temperature and time scales about postmortem interval（PMI）in early stage by calculating ATP of RBCs.Methods 40 mL blood collected from 12 healthy donors were stored at 15，20，25，30℃respectively.Technical parameter as ATP content in RBCs was tested every 4 hours using bioluminescence assay.By statistical analysis，the regression equations and deviations of time point were obtained.Results There was a large gap on mean time deviation among 4 groups.The mean time deviation was 4.80 h in the 15℃group，2.04 h in the 20℃，1.77 h in the 25℃and 5.71 h in the 30℃.Meanwhile，the mean time deviation was reduced from 5.71 h to 1.67 h over time in the 30℃group.Conclusion The best suitable temperature scale of ATP content in RBCs is during 20-30℃. Effective time scale is 64 h at 20℃，40 h at 25℃，28 h at 30℃.

Postmortem intervals；ATP content in RBCs；Temperature of surroundings

ea B，Henssg C，Honig W.

for determing the time of death by potassium in vitreous humor［J］. Forensic Sci Int，1989，40（3）：231-243.

R446.11

A

1673-7210（2015）12（b）-0008-04

2015-09-10本文编辑：程铭）

公安部应用创新计划项目（2009YYCXBJSJ002）。▲并列第一作者

焦章平（1971-），男，主任法医师；研究方向：法医物证检验及研究。于群（1970-），男，研究员；研究方向：蛋白质修饰在疾病防治中的应用。