有性杂交选育银耳优良菌株的初步研究

贺元川陈仕江杨勇贺宗毅张德利柴佳炎

（1. 重庆市中药研究院，重庆 400065；2. 重庆黔江朵朵润耳责任有限公司，重庆 409000）

有性杂交选育银耳优良菌株的初步研究

贺元川1陈仕江1杨勇1贺宗毅1张德利1柴佳炎2

（1. 重庆市中药研究院，重庆 400065；2. 重庆黔江朵朵润耳责任有限公司，重庆 409000）

为了解决银耳栽培生产中存在菌株优良性状单一，生产效率较低等问题，采用银科1#和Tr21两个不同品种菌株为亲本菌株，通过单孢子分离选取50个有性孢子单核体、两两配对有性杂交试验，显微观察镜检鉴定，统计杂交成功率为36%、杂交菌株与亲本的拮抗试验选育出7株杂交株，栽培对比农艺性状评价选育出1株（GT3）比亲本菌株生长快，生物转化率较高的菌株。试验结果表明有性杂交育种可作为一种行之有效的筛选银耳优良菌株的方法。

银耳；单孢分离；有性杂交；优良菌株

银耳（Tremella fuciformis）又称白木耳。在真菌分类学中隶属于担子菌门（Basidiomycota）、银耳纲（Tremellomycetes）、银耳目（Tremellales）、银耳科（Tremellaceae）。银耳是一种药用价值极高的药食真菌，性平、味甘淡、无毒，具有提高肝脏解毒能力、保护肝脏、增强机体抗肿瘤能力、扶正固本的功效，历来是一种高级滋养补品［1］。银耳在药食用菌产量中占重要地位，其栽培业成为福建古田、四川通江、重庆黔江等地的重要产业。近年来由于育种工作选育的滞后，严重影响了该产业的发展，因此对银耳高产优质菌株的筛选和选育工作势在必行。目前的栽培银耳品种普遍存在菌种衰退快、产量不高、抗逆性差、适应性弱等现象，已严重影响银耳的产量与品质，阻碍了银耳产业的健康发展［2］。

药食用菌的常用育种途径主要有：野生驯化、孢子分离、杂交育种，其他如原生质体融合技术、基因工程育种、诱变育种等新技术，手段也在不断的尝试中。杂交育种自20世纪80年代以来，香菇、金针菇、木耳等食用菌新品种都通过杂交育种，并陆续投入生产，加快了我国成为食用菌超级大国的步伐。目前杂交育种在食用菌新菌株选育中占有重要的地位，逐渐成为食用菌新品种筛选的有力手段和方法［3］。银耳属于双因子控制的四极性异宗配合菌类，一个担子能产生4个不同极性的有性孢子，它们之间交配反应受两套因子控制，A（a）和B（b），A因子控制配对芽孢萌发管的产生，B因子控制配对产生的萌发管是否形成具有锁状联合的双核菌丝。只有担孢子杂交后获得AaBb等位基因的双核菌丝才能成功出耳［4］。但是银耳育种的报道有太空育种，诱变育种等，当时仅限于实验室研究，由于变异的不定向，不稳定导致后期筛选工作繁杂，尚未将稳定菌株应用于实际生产当中［5］。杂交育种将亲本的优良菌株整合到杂交株中，对于筛选具有多个优良特性的杂交株提供了参考。本研究拟筛选具有优良特性的亲本菌株，采用单孢子分离、有性孢子杂交育种、显微鉴别等技术筛选出杂交菌株，并通过栽培试验，比较农艺性状等，以进一步筛选出具有二者亲本优良特性的杂交菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 Tr21：子实体成熟时耳片舒展，较白，无小耳蕾，蒂头黄，耳片下垂，弹性强，菊花形，朵直径10-14 cm，产量高，单朵鲜重90-150 g，栽培周期35-42 d，抗逆性强，生物转化率约0.93%-1.34%（干重），子实体形态见图1。银科1#：子实体成熟时耳片舒展，米黄色，无小耳蕾，蒂头黄，耳片肥厚，弹性强，牡丹花形，朵型圆整，直径10-15 cm，产量较高，单朵鲜重90-120 g，栽培周期33-40 d，生物转化率0.93%-1.25%（干重），子实体形态见图2。

图1 Tr21菌株子实体

图2 银科1#菌株子实体

1.1.2 培养基配方

1.1.2.1 PDA培养基（1 L） 去皮土豆200 g，蔗糖20 g，蛋白胨5 g，琼脂20 g，硫酸镁3 g，磷酸二氢钾2 g，pH5.2-5.8。

1.1.2.2 CM培养基（1 L） 香灰木屑100 g，去皮土豆200 g，蔗糖20 g，蛋白胨5 g，琼脂15-18 g，硫酸镁3 g，磷酸二氢钾2 g，pH5.2-5.8。

1.1.2.3 栽培种培养基 青杠木屑78%，麸皮20%，蔗糖1%，石膏1.2%，硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.2%，水分65%。

1.1.2.4 栽培袋培养基 棉耔壳83.5%，麸皮15%，石膏1.5%，蔗糖1%，硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.2%，水65%。

1.2 方法

1.2.1 单孢子分离 选取发育健壮，无病虫害的成熟的耳片，在超净工作台内用无菌水充分洗涤，然后用无菌滤纸吸干水分，采用钩悬法在小三角瓶内收集孢子。取少量无菌水至三角瓶中，充分混匀，计数，梯度稀释至10-5/mL，从各梯度中分别吸取150 μL孢子悬浮液于CM平板上面并涂布均匀，于25℃恒温培养7-10 d，挑选萌发菌丝的菌落镜检，观察有无锁状联合，挑取单孢子萌发的菌落用于后续试验。

1.2.2 杂交配对 随机挑取银科1#和Tr21菌株的单孢子两两配对杂交，在同一CM平板上相距0.5 cm接种，于25℃下培养，当两种单核菌丝接触萌发菌丝后镜检，有锁状联合的菌丝表明配对成功，将其挑至斜面培养，培养后备用。

1.2.3 拮抗试验 在PDA培养基平板内，采用三点接种法分别接种2个亲本菌株与杂交新菌株。每2点间隔1 cm，接种后25℃恒温箱内培养，观察记录各菌株间拮抗状况。

1.2.4 酶活力的测定 按照上述培养料的配方，采用常规方法进行栽培种的培养，测定杂交菌株与对应香灰菌配比后长满瓶是白毛团和混合菌丝的纤维素酶，漆酶，多酚氧化酶的活力。分别在菌种瓶中间均匀取白毛团和混合菌丝各5 g（鲜重），加入25 mL蒸馏水并搅匀，浸提2 h后进行抽滤，抽滤后的溶液即为菌丝粗酶液。酶活力测定的具体原理和方法参照施特尔马赫B著、钱嘉渊译的《酶的测定方法》［6］。

1.2.5 栽培对比试验 将杂交菌株与亲本进行栽培对比试验，每个菌株3个重复，每个重复3袋，每袋干料300 g，测定各菌株的子实体产量，培养周期，计数生物学效率，对每个菌株的子实体随机取样，测定各个菌株的鲜重和子实体形态特征，以筛选出优于亲本的优良菌株。

2 结果

2.1 单孢子分离结果

图3显示了单孢子分离平板生长情况，早期萌发菌丝镜检可发现锁状联合；前期似酵母样的菌落，后期逐渐萌发菌丝，无锁状联合，荧光显微观察，酵母样菌落为单核细胞，被确定为单孢子萌发菌丝。早期萌发的菌落可能是亲本孢子液体涂布没有完全分离所致，形成双核菌丝以及具有锁状联合特征。

图3 单孢子分离试验结果

2.2 单孢子配对试验结果

根据杂交株具有双核菌丝和锁状联合特征，以及双核菌丝和单核菌丝萌发速度的差异，借助显微镜镜镜检鉴定，共筛选出18株杂交菌株，有性杂交成功率达到36%。根据银耳的双因子四极性特点，尚未配对的菌株是因为配对中缺乏完全配对的因子，导致无法萌发出双核，锁状联合的菌丝［4］。

2.3 拮抗试验结果

18株杂交菌株与亲本拮抗试验的结果显示，其中7株杂交菌株与2个亲本存在明显的拮抗线，11株无显著的拮抗线。拮抗线是不亲和的菌株共同培养是在交界处形成的隔离，阻碍遗传上明显不同的菌株融合，保持了个体遗传上的独立和稳定。杂交菌株与亲本菌株之间形成拮抗线表明遗传物质差异较大，则可能为筛选的新品种［7］。将有明显拮抗线的杂交菌株依次编号GTi（i=1，2，3……），转管备用。

2.4 杂交菌株的酶活力测定结果

将7株菌株分别与亲本的香灰菌配对制备银耳栽培种，当栽培种生长完成时，测定白毛团的纤维素酶活力和香灰菌丝的漆酶和多酚氧化酶活力，同时接种至栽培袋进行栽培对比试验。表1显示不同杂交菌株的酶活力，其中GT1、GT6、GT7菌株的纤维素酶活力介于亲本之间，GT4比两个亲本的酶活力都低，GT2、GT3、GT5纤维素酶的活力略高于亲本，由此可见，有性杂交并不是简单的遗传物质的组合。漆酶和多酚氧化酶的活力与对应亲本的酶活力进行t检验分析，其值均大于0.05，无显著差异。

2.5 栽培试验比较结果

7株杂交菌株与2亲本进行了小规模的栽培对比试验，测定了栽培种酶活力，统计生长周期，单朵直径，耳片情况，单朵直径、鲜重和生物学效应等农艺性状，表2显示了相关数据信息。整理数据分析发现杂交菌株GT3的鲜重，耳片展片完全，弹性较好，生长周期较短，抗污染能力较好，鲜重和转化率与亲本相比略高；其余菌株有的生长周期延长，生物学效率降低，为表现出亲本各自的优势。GT3可能具备开发为优良菌株的潜力，该菌株的稳定性还需进一步的证实。

表2 杂交菌株栽培对比试验结果

3 讨论

本试验完成了银耳有性孢子分离，配对筛选，从50个单孢子菌落配对仅仅获得18个菌株，在18个菌株种仅7个杂交菌株和亲本菌株有明显的拮抗现象，表明此杂交菌株与亲本菌株遗传物质具有明显区别，有可能为选育的新品种［8］。栽培种酶活力测定结果显示，某些菌株纤维素酶活力较亲本强，多数介于二者之间，少数低于亲本。从栽培试验中发现纤维素酶活力高，生长周期相对缩短，漆酶、多酚氧化酶活性相对变化较小，但是活力高，提供营养物质可能较多，对生物学效率提供具有一定的意义［9-11］。综合栽培时间、生物转化率等农艺学参考因子，GT3杂交菌株具有生长周期短，生物转化率高和抗逆性强等优良特征，该杂交菌株与两种香灰菌株均可配对，关于该菌株的稳定性、是否能优良菌株应用于生产还需要进一步试验［12，13］。

4 结论

本研究通过银耳有性孢子的分离、有性孢子杂交育种、农艺性状的评价等筛选出一株具有生长周期短，生物转化率高，抗逆性强的杂交菌株。该菌株与亲本有明显的拮抗现象，酶活力较亲本缩短。

［1］ 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草［M］.上海：上海科技出版社， 1998：515-519.

［2］ 彭卫红、王勇、黄忠乾， 等. 我国银耳研究现状与存在问题［J］.食用菌基础， 2005， 12（1）：51-56.

［3］付立忠、吴学谦， 魏海龙， 等.我国食用菌育种技术应用研究现状与展望［J］.食用菌学报， 2005， 12（3）：63-68.

［4］陈明， 陈立国， 汪国莲. 银耳极性测定的初步研究［J］.华中农业大学学报， 2000， 19（2）：138-141.

［5］刘佳. 通江银耳乘“神八”育种是否成功需要3年验证［N］.四川日报， 2011-11-22（21302）.

［6］ 施特尔马赫（German ）（钱嘉渊译）. 酶的测定方法［M］.北京：中国轻工业出版社， 1992：10-280.

［7］ 陈绢， 苏开美.食用菌遗传育种与种质鉴定研究进展［J］. 中国食用菌， 2008（5）：3-7.

［8］ 张树强， 卫彩红， 胡建伟.鸡腿菇单孢分离与单孢杂交的研究［J］.新疆农业科学， 2012， 49（1）：190-194.

［9］ 温志强， 白盛镇， 邓优锦. 不同菌龄银耳菌种的酶活力测定［J］.食药用菌， 2011， 4：25-27.

［10］戴维鸿， 戴维浩.银耳不同菌龄的菌种对产量与品质的影响试验［J］. 食药用菌， 2010， 4：28-29.

［11］ 贺元川， 陈仕江， 杨勇， 等.香灰菌传代对银耳栽培的影响［J］.江苏农业科学， 2014， 42（4）：201-202.

［12］ 邓优锦， 王庆福， 刘福阳，等.不同香灰菌与银耳的配对研究［J］.食药用菌， 2012， 20（1）：25-27.

［13］张汉文.浅谈提升银耳菌种稳定性及其技术线路的探讨［C］.国际食（药）用菌生物科学高峰论坛暨第二届中国（古田）食用菌节-纪念中国食用菌协会成立二十周年论文集， 137-138.

（责任编辑 李楠）

Sexual Hybridization Breeding Selection for Good Quality Strain of Tremella fuciformis

He Yuanchuan1Chen Shijiang1Yang Yong1He Zongyi1Zhang Deli1Chai Jiayan2
（1. Chongqing Academy of Chinese Material Medica，Chongqing 400065；2. Chongqing Duoduoruner Co.，Ltd，Chongqing 409000）

During the process of Tremella fuciformis cultivation， some problems， such as low yield and long cultivation time， often are followed with different strains. The aim of this study is to mix good properties of different strain together to new strains by sexual hybridization method. Based comparison of yield， fresh ear ventral color and mature culture， yinke 1#and Tr21 were selected as parents strains with good properties. 50 single spores were isolated from fresh ear and partnered each other following single hybridization principle. 17 combinations are identified with an optical microscope examination and 7 genetic characteristics of hybrid strains are different from parent strains by Antagonism experiment. The results of agronomic traits comparison showed that cultivation period， diameter and the yield of hybrid strains GT3are significantly different from the parents， and the production has exceeded the parent strains more than 3%. GT3can be used as an excellent hybrid strains reserves and has the potential to develop into a new species. Sexual hybridization breeding would be effective way to select good quality strain.

Tremella fuciformis；single spore isolation；sexual hybridization；good quality strain

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.022

2014-08-21

重庆市科技攻关项目（JA-12-21-1）

贺元川，女，硕士，助理研究员，研究方向：药食用菌培养及活性物质；E-mail：heyuanchuan@126.com

陈仕江，男，研究员，研究方向：药食用菌的培植；E-mail：shijiangchen@163.com