吡咯烷二硫代氨基甲盐酸对人鼻咽癌C N E-2Z细胞增殖及其细胞核抗原表达的影响

向银洲　彭　平　许　军　章松勤　宁　娜

三峡大学人民医院宜昌市第一人民医院耳鼻咽喉科，湖北宜昌443000

吡咯烷二硫代氨基甲盐酸对人鼻咽癌C N E-2Z细胞增殖及其细胞核抗原表达的影响

向银洲彭平许军章松勤宁娜

三峡大学人民医院宜昌市第一人民医院耳鼻咽喉科，湖北宜昌443000

目的研究核转录因子-κB（NF-κB）特异性抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲盐酸（PDTC）对人鼻咽癌CNE-2Z细胞生长增殖及其细胞核抗原（PCNA）的影响。方法不同浓度的PDTC（25、50、100 μmol/L）作用CNE-2Z细胞不同时间后（24、48、72 h），四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测PDTC对CNE-2Z细胞增殖的抑制效应；不同浓度的PDTC（25、50、100 μmol/L）作用于CNE-2Z细胞48 h后，流式细胞术（FCM）分析细胞周期，免疫组化（SP）法检测不同强度PDTC作用下CNE-2Z细胞增殖细胞核抗原（PCNA）的表达情况。结果25、50、100 μmol/L PDTC处理的CNE-2Z细胞增殖活性明显受到抑制（P＜0.05），并呈时间和剂量依赖；流式细胞术结果表明S期细胞数减少，细胞受阻于G0/G1期。与对照（无PDTC处理）比较，PDTC作用后CNE-2Z细胞PCNA表达降低（P＜0.05），并呈明显的剂量依赖。结论PDTC具有显著抑制人鼻咽癌CNE-2Z细胞生长的作用，是一种有潜力的抑制鼻咽癌细胞增殖的药物。

人鼻咽癌CNE-2Z细胞；吡咯烷二硫代氨基甲盐酸；核转录因子-κB；增殖细胞核抗原

鼻咽癌是我国南方地区常见的头颈部恶性肿瘤，治疗以放射治疗为主，目前早期鼻咽癌患者3年生存率约为90%，5年生存率为78%左右；但晚期患者生存率仍不乐观，绝大多数患者死于肿瘤的局部复发和远处转移，5年生存率一直徘徊在40%左右［1］。因此在提高放疗水平的同时，积极探讨化学药物治疗尤为重要。核转录因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）在许多生理、病理过程中发挥着基因调控作用，如炎性反应、免疫应答、细胞增殖与凋亡等，肿瘤的发生、侵袭、转移等过程也与NF-κB密切相关，NF-κB是一类极其重要的多功能核转录因子［2］。NF-κB特异性抑制剂近年在肿瘤防治中的作用受到广泛关注，其作用机制可能是通过抑制核转录因子NF-κB的活化，从而间接抑制下游相关基因的表达，达到抑制肿瘤细胞的生长增殖、侵袭与转移。本实验中选用NF-κB的特异性抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲盐酸（pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC）作为干预因素，作用于人鼻咽癌CNE-2Z细胞，观察PDTC对CNE-2Z细胞生长增殖及PCNA表达的影响。

1　材料与方法

1.1实验材料

人鼻咽癌CNE-2Z细胞株由第三军医大学肿瘤研究所中心实验室提供。胎牛血清购自杭州四季青生物工程有限责任公司；DAB显色试剂盒与SP-9000免疫组织化学试剂盒购自武汉百奥斯生物科技有限公司；四甲基偶氮唑蓝（MTT）显色剂购于上海生物工程有限责任公司；RNA酶（RNase）、PDTC分析纯、碘化丙啶（PI）、二甲基亚砜（DMSO）、RPMI1640培养基、胰蛋白酶等分别购于Hyclone、Sigma、Amresco公司。

1.2CNE-2Z细胞的培养

复苏人鼻咽癌细胞株CNE-2Z，将复苏后的细胞接种于100 mL培养瓶中，加入含10%灭活胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的RPMI-1640培养液，放置于37℃、5%二氧化碳、饱和湿度的恒温培养箱中培养。常规更换培养液，进行正常传代，选取对数生长期细胞进行后续实验。

1.3CNE-2Z细胞形态学观察

随机在倒置显微镜下选取3个视野，观察不同浓度PDTC（浓度分别为25、50、100 μmol/L）作用于CNE-2Z细胞不同时间点（24、48、72 h）的形态学变化。CNE-2Z细胞以5×104/mL浓度接种于预置盖玻片的6孔板中，然后每孔中滴加1 mL细胞悬液，再加入适量含10%灭活胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的RPMI-1640培养液，于37℃、5%二氧化碳、饱和湿度的恒温培养箱中培养，细胞贴壁生长后分为4组，分别滴加含PDTC（25、50、100 μmol/L）的培养液；设未加PDTC为对照，继续培养72 h后，去除培养液，用PBS洗涤3次，加入95%的乙醇室温下固定30 min，取出盖玻片，常规HE染色，透明树脂封片，自然晾干，光镜下观察细胞形态。

1.4四甲基偶氮唑蓝比色法检测PDTC对CNE-2Z细胞生长增殖的抑制作用

采用对数生长期的CNE-2Z细胞，0.25%胰蛋白酶消化细胞，调整细胞悬液浓度为5×104/mL，每孔200 μL接种于96孔板上，同时设空白对照组、正常对照组（不含药物）和PDTC不同浓度药物处理组（分别为25、50、100 μmol/L），每组重复4孔，于37℃、5% CO2、饱和湿度恒温箱中培养24 h后，吸去每孔培养液，实验组分别滴加含不同浓度PDTC培养液，继续培养24、48、72 h，再每孔滴加20 μL MTT（5 mg/mL），继续培养4 h后吸去上清液，每孔滴加150 μl DMSO液，遮光振荡10～20 min，使其溶解，用Quant酶标仪570 nm波长检测各孔吸光度（A570），只加RPMI-1640、未接种细胞的空白对照调零。每组实验重复3次，取平均值。计算不同浓度PDTC对CNE-2Z细胞增殖的抑制率。细胞抑制率=（1-药物处理组吸光度/阴性对照组吸光度）×100%［3］。

1.5CNE-2Z细胞周期分析

采用流式细胞仪（FCM）检测细胞周期.选取对数生长期CNE-2Z细胞，轻轻吹打，调整细胞浓度为1×105/mL，将细胞接种于100 mL培养瓶中，加入适量含10%灭活胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的RPMI-1640培养液，在37℃、饱和湿度、5%二氧化碳的孵箱中培养24 h，待细胞生长至70%～80%融合时，更换为含PDTC为25、50、100 μmol/L的培养液，设对照，继续培养48 h后吸去培养液，用胰蛋白酶消化、收集细胞，PBS冲洗3次，用预冷的70%冰乙醇固定，置4℃冰箱过夜，吸去乙醇，PBS冲洗3次，调整细胞浓度为1×106/mL，加入RNase酶（20 μg/mL）200 μL消化30 min，加入碘化丙啶（20 μg/mL）1 mL，于室温遮光染色30 min，上流式细胞仪检测，每组重复3次，Cell Quest及Modifit软件分析细胞周期分布。

1.6免疫组化法检测PDTC作用下CNE-2Z细胞PCNA的表达

选取对数生长期CNE-2Z细胞，制成5.0×104/mL浓度细胞悬液，每孔2 mL接种于预置盖玻片的6孔板中，放入37℃、饱和湿度、5%二氧化碳的恒温箱中培养24 h，更换无血清RPMI1640培养液继续培养24 h，去除培养液，实验组中分别滴加浓度为25、50、100 μmol/L含PDTC的培养液，对照组滴加含10%灭活胎牛血清RPMI 1640培养液，每孔2 mL。培养48 h后吸去各孔培养液，0.01 mmol/L PBS液洗涤3次，再以乙酸-甲醛溶液（浓甲醛10 mL，冰乙酸3 mL，0.9%的氯化钠溶液加至100 mL）固定10 min。采用SP染色检测CNE-2Z细胞中PCNA的表达，操作按说明书步骤进行，然后用DAB染色盒染色，晾干，透明树胶封片，光镜下观察CNE-2Z细胞PCNA表达。CNE-2Z细胞中PCNA阳性表达标准为细胞核中可见棕黄色颗粒。HSCORE评分：排除爬片边沿细胞，在低倍镜下随机选取细胞分布均匀的视野10个，然后在高倍镜下每个视野随机选择50个细胞，根据细胞核着色深浅进行PCNA蛋白表达评分：①阴性：0分，胞核不着色；②弱阳性：1分，胞核呈淡黄色；③阳性：2分，胞核呈黄色；④强阳性：3分，胞核呈深棕色。根据公式HSCORE=ΣPi（i+1）（i=0，1，2，3；Pi表示评分为i的比例）计算细胞HSCORE得分［4］。

1.7统计学方法

采用统计软件SPSS 17.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1CNE-2Z细胞形态学观察

倒置显微镜观察细胞贴壁生长24 h后，可见CNE-2Z细胞形态呈多角形，胞体透亮，细胞轮廓清晰，折光性强，胞核大而深染，核仁明显，可见巨核和多核细胞（图1，封四）。加入PDTC作用后，CNE-2Z细胞的贴壁性下降，细胞皱褶增多，形态逐渐由多角形变为圆形，细胞间隙增宽；细胞结构变得模糊不清，部分细胞明显水肿，胞浆浓缩，胞核聚集，甚至细胞破碎，可见细胞碎片。随着PDTC浓度的增加和作用时段的延长，较多细胞悬浮于培养瓶中（图2，封四）。HE染色光镜观察，PDTC作用后，CNE-2Z细胞数量显著减少，细胞形态变为不规则形，细胞核空染，随PDTC浓度增高，CNE-2Z细胞死亡增加。

2.2不同浓度PDTC处理后CNE-2Z细胞增殖的抑制率

不同浓度PDTC处理的CNE-2Z细胞增殖活性明显受到抑制（P＜0.05），并呈时间和剂量依赖。见表1。

表1　不同浓度PDTC处理后CNE-2Z细胞增殖的抑制率（n=4，%，±s）

表1　不同浓度PDTC处理后CNE-2Z细胞增殖的抑制率（n=4，%，±s）

注：与对照同时间比较，aP＜0.05；与25 μmol/L比较，bP＜0.05；与50 μmol/L比较，cP＜0.05；与同组24 h比较，dP＜0.05；与同组48 h比较，eP＜0.05；PDTC：吡咯烷二硫代氨基甲盐酸

PDTC浓度（μmol/L）24 h48 h72 hP值0（对照）25 50 100 P值0 0 0-19.54±3.47a26.64±2.78ab37.59±3.19ac＜0.05 30.23±4.12ad37.24±4.53abd47.50±4.05acd＜0.05 34.20±3.21ae44.15±3.08abe59.47±2.89ace＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05 -

2.3不同浓度PDTC对CNE-2Z细胞周期的影响

不同浓度PDTC作用24 h后，随着药物浓度增加，S期细胞所占比例逐渐下降（P＜0.05），G0/G1期细胞所占比例逐渐增高（P＜0.05），细胞主要呈现G0/G1期阻滞。见表2。

表2　不同浓度PDTC对CNE-2Z细胞周期的影响（n=4，%，±s）

表2　不同浓度PDTC对CNE-2Z细胞周期的影响（n=4，%，±s）

注：与对照比较，**P＜0.05

?

2.4不同浓度PDTC作用于CNE-2Z细胞后PCNA蛋白的表达

对数期生长的CNE-2Z细胞，可见细胞核有明显棕色或棕黄色颗粒着色，PCNA蛋白表达强阳性（图3，封四）。PDTC作用后，CNE-2Z细胞胞核棕黄色颗粒减少，随着PDTC浓度增高，细胞核棕黄色颗粒颜色变浅（图4，封四），表明PCNA表达减弱。不同浓度的PDTC（0、25、50、100 μmol/L）作用48 h后，PCNA蛋白的表达评分为（2.92±0.10）、（2.22±0.18）、（1.45± 0.22）、（1.02±0.15）分，随着PDTC浓度增高，PCNA蛋白的表达评分逐步降低（P＜0.05），呈现一定的剂量依赖。

3　讨论

NF-κB是一种重要的多功能核转录因子，是由P65和P50构成的杂二聚体，在人体的应激、免疫应答、炎性反应等方面以及肿瘤的形成、侵袭、扩散等方面发挥着重要的基因调控作用。研究发现NF-κB能够显著促进肿瘤细胞生长增殖，抑制细胞凋亡，其抗凋亡机制极可能是通过调控其靶基因相关因子，如肿瘤坏死因子、集落刺激因子、白介素-1、白介素-2等，使NF-κB过度表达，导致肿瘤细胞无限制生长，出现细胞增殖，细胞凋亡减少，促使肿瘤发生、侵袭和扩散［5］. NF-κB还可以通过直接干扰与细胞周期相关的因子如IL-2等，使细胞的DNA合成异常加速，从而导致肿瘤细胞增殖而形成肿瘤［6］。有研究发现PDTC和顺铂在体外联合应用后，对人鼻咽癌细胞株CNE-2Z抑制效应增加，中效浓度比单用药要小，这说明PDTC可能具备化疗增敏作用［7］。

PCNA是一种分子量为36 kD的蛋白质，是DNA复制时聚合酶δ的辅助蛋白，在细胞核内合成，并存在于细胞核内。PCNA影响着细胞的增殖周期，在细胞DNA合成、细胞有丝分裂中发挥着重要作用。PCNA存在可溶性和不溶性两种，不溶性PCNA可以在DNA复制中起作用，同时调控细胞增殖及细胞周期，研究发现其在G0/G1期细胞中表达不明显，在G1晚期，其表达显著增加，S期表达达最高峰，G2/M期则明显下降［8］。PCNA表达的量的变化与DNA合成一致，其在细胞核内阳性表达的强弱与细胞增殖活性密切相关，其活性越高，细胞与细胞间张力越大，黏附性越小，容易促使肿瘤细胞向远处转移、侵袭和扩散。因此PCNA的表达强度可以比较客观地反映肿瘤细胞的增殖活性，是一种能够准确、简便评估肿瘤细胞增殖能力的重要指标［9］。

NF-κB特异性抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲盐酸（PDTC）是一种强抗氧化剂，能够特异性抑制多种肿瘤细胞NF-κB的活化，其作用机制主要为：①NF-κB活性亚单位P65的表达能够被特异性抑制；②可能通过抑制NF-κB抑制蛋白（IκB）的降解，从而减少了NF-κB的核移位［10］。江从军等［11］研究发现，特异性阻断NF-κB的活化可显著抑制体外实体瘤细胞的生长，肿瘤的发生率大大降低。Gao等［12］研究发现NF-κB抑制剂PDTC通过可下调血管内皮因子（VEGF）的表达，减少路易斯肺癌小鼠肿瘤血管生成，从而抑制肿瘤的形成；Li等［13］发现NF-κB信号途径与视网膜细胞瘤的生物学行为也有关系。研究发现PDTC对肾癌、肝癌、喉癌细胞有显著的抑制作用［14-16］；对胃癌、白血病、宫颈癌细胞有明显抑制生长作用［17-19］，对人鼻咽癌细胞的转移与预后也有较大影响［20］。

本研究中采用NF-κB特异性抑制剂PDTC以不同浓度作用于人鼻咽癌CNE-2Z细胞后，发现PDTC能显著抑制CNE-2Z细胞生长增殖，表现为细胞黏附性下降，细胞间隙增宽，部分细胞胞核聚集，胞质浓缩，甚至出现细胞碎裂。在增加PDTC浓度和延长作用时间后，大量细胞悬浮于培养瓶中。HE染色结果显示，PDTC干预后，CNE-2Z细胞数量明显减少，形态变为圆形或椭圆形，细胞内出现大颗粒物质及空泡；随着PDTC浓度递增，死亡细胞明显增多。MTT试验表明，CNE-2Z细胞的增殖代谢能够显著地被PDTC抑制，同时也具有一定的剂量和时间依赖。经PDTC作用24 h后，分析CNE-2Z细胞的周期，发现与对照细胞相比，PDTC作用的细胞G2/M期和S期细胞明显减少（P＜0.05），而G0/G1期细胞显著增多（P＜0.05），CNE-2Z细胞生长过程明显受阻于G0/G1期。免疫组化结果显示，PDTC作用于CNE-2Z细胞后，PCNA蛋白表达下降，浓度越高，细胞核着色越浅。

综上所述，PDTC能显著抑制人鼻咽癌CNE-2Z细胞生长增殖，其机制可能是PDTC阻断NF-κB活化，下调PCNA表达，抑制细胞DNA合成和有丝分裂，减少细胞的生长增殖；改变细胞周期分布，使CNE-2Z细胞受阻于G0/G1期等，促进细胞凋亡，抑制了CNE-2Z细胞生长增殖。PDTC在肿瘤生长增殖方面的作用，使其可能成为肿瘤治疗的新靶点。

［1］张继屏，范静平，邓月，等.Ki67和nm23蛋白在鼻咽癌中的表达及临床意义［J］.中国眼耳鼻喉科杂志，2015，15（1）：20-24.

［2］陈李影慧，吴武佳，秦东春，等.PDTC对A549细胞增殖、细胞周期、凋亡及星形细胞上调基因-1表达的影响［J］.郑州大学学报：医学版，2013，48（4）：485-488.

［3］向银洲，余林，魏莲枝，等.冬凌草甲素对鼻咽癌HNE-1细胞株生长及PCNA、Caspase-3表达的影响［J］.山东医药，2010，50（50）：20-22.

［4］Cetinkaya BO，Pamuk F，Keles GC，et al.The role of phosphatase and tensin homolog in drug-induced gingival overgrowth［J］.Periodontal Res，2014，49（3）：307-313.

［5］Zhi Y，Duan Y，Zhou X，et al.NF-κB Signaling Pathway Confers neuroblastoma cells migration and invasion ability via the regulation of CXCR4［J］.Med Sci Momit，2014，20（12）：2746-2752.

［6］Oida Y，Gopalan B，Miyahara R，et al.Inhibition of nuclear factor-kappa B augments antitumor activity of adenovirus-medicated melanoma differentiation-associated gege-7 against lung cancer cells via mitogen-activated protein kinase l activation［J］.Mol Cancer Ther，2007，6（4）：1440-1449.

［7］李蓉，黎小兵，李明勇，等.PDTC和顺铂对人鼻咽癌细胞株CNE1、CNE-GL、CNE2Z的联合作用［J］.广东医学院学报，2010，28（6）：607-610.

［8］Wang SC.PCNA：a silent housekeeper or a potential therapeutic target？［J］.Trends Pharmacol Sci，2014，35（4）：178-186.

［9］李旭涛，田芳.COX-2、PCNA表达与乳腺癌术后用生血汤联合新辅助化疗疗效的关系［J］.中国医药导刊，2015，17（1）：96-98.

［10］Zhang X，Wu M，Jiang H，et al.AngiotensinⅡUpregulates endothelial lipase expression via the NF-Kappa B and MAPK signaling pathways［J］.Plos One，2014，9（9）：e107634.

［11］江从军，用艳梅，张汝芝，等.NF-κB抑制剂PDTC对人黑素瘤A375细胞增殖的影响［J］.齐齐哈尔医学院学报，2012，33（18）：2445-2446.

［12］Gao P，Gao Y，Liang H.Effect of NF-κB inhibitor PDTC on VEGF and endostatin expression of mice with Lewis lung cancer［J］.Asian Pacific Journal of Tropical Medicine，2015，20（3）：220-224.

［13］Li P，Li Z.Effects of NF-κB and hypoxia on the biological behavior of Y79 retinoblastoma cells［J］.Int J Clin Exp Pathol，2015，8（2）：1725-1730.

［14］Zheng X，Lv J，Shen Q，et al.Synergistic effect of pyrrolidine dithiocarbamate and cisplatin in human cervical carcinoma［J］.Reprod Sci，2014，21（10）：1319-1325.［15］罗娜，何松，汤为学，等.二硫代氨基甲酸吡咯烷联合苦参碱对人肝癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用［J］.中华肝脏病杂志，2011，19（4）：275-280.

［16］康苎心，胡国华，吴蔚，等.PDTC对喉癌裸鼠模型中循环肿瘤细胞的影响［J］.临床耳鼻咽喉头颈外科杂志，2011，25（9）：419-422.

［17］夏秀丽，张志广，李熳，等.塞来昔布联合PDTC对人胃癌细胞株SGC-7901生长的抑制作用［J］.天津医药，2011，39（10）：907-910.

［18］张纯，崔国惠，刘芳，等.NF-κB抑制剂PDTC抗白血病细胞增殖的实验研究［J］.中国病理生理杂志，2009，25（12）：2349-2352.

［19］吴静，闰亚妮，张颖，等.抗氧化剂PDTC对卡铂诱导宫颈癌HeLa细胞增殖和凋亡的影响［J］.肿瘤，2010，30（11）：908-912.

［20］Sun W，Guo MM，Han P，et al.Id-1 and the p65 subunit of NF-κB promote migration of nasopharyngeal carcinoma cells and are correlated with poorprognosis［J］.Carcinogenesis，2012，33（4）：810-817.

Effects of pyrrolidine dithiocarbamate on proliferation and nuclear antigen expression of human nasopharyngeal carcinoma cell line CNE-2Z

XIANG YinzhouPENG PingXU JunZHANG SongqinNING Na
Department of Otolaryngology，the People's Hospital of China Three Gorges University the First People's Hospital of Yichang City，Hubei Province，Yichang443000，China

Objective To explore the effects of pyrrolidine dithiocarbamate（PDTC），a specific inhibitor of NF-κB on the proliferation of human nasopharyngeal carcinoma cell line CNE-2Z and its effect on proliferation cell nuclear antigen（PCNA）expression.Methods CNE-2Z cells were respectively treated with different concentration（25，50，100 μmol/L）PDTC and different time（24，48，72 h）.The inhibition effects of cell proliferation were assayed by four methyl thiazolyl tetrazolium colorimetric（MTT）method.Cell cycle was analyzed by flow cytometry and the expression of proliferating cell nuclear antigen（PCNA）was detected by immunocytochemical method after treating CNE-2Z cells with different concentration PDTC（25，50，100 μmol/L）after 48 h.Results The proliferation activity of CNE-2Z cells dealed with 25，50，100 μmol/L PDTC was inhibited obviously（P＜0.05），and it showed a time-dependent and dose-dependent manner.FCM result showed that the cell population reduced in S phase and the cell cycle was arrested in G0/G1phase.Compared with the control（no PDTC），the expression of PCNA of CNE-2Z cells was down regulated after PDTC dealed with（P＜0.05），and it showed a dose-dependent manner.Conclusion The growth of CNE-2Z can be inhibited and the expression of PCNA in CNE-2Z can could be down-regulated by PDTC.PDTC may be a potential chemotherapeutics for the proliferation of nasopharyngeal carcinoma cell line.

Human nasopharyngeal carcinoma cell line CNE-2Z；Pyrrolidine dithiocarbamate；NF-κB；Proliferation cell nuclear antigen

R286.91

A

1673-7210（2015）09（a）-0011-05

2015-05-18本文编辑：苏畅）

湖北省宜昌市医疗卫生科研项目（AL4301-16）。

向银洲（1971.3-），男，硕士，副主任医师；研究方向：头颈肿瘤基础与临床。