普罗布考对高同型半胱氨酸血症大鼠血管功能的保护作用

高胜利　李　莉　翟晓娟　郭任维　燕　子　高淑红

1.山西医科大学汾阳学院生理学教研室，山西汾阳032200；2.山西医科大学附属汾阳医院心血管内科，山西汾阳032200；3.山西医科大学生理学系，山西太原030001；4.山西医科大学汾阳学院统计学教研室，山西汾阳032200

普罗布考对高同型半胱氨酸血症大鼠血管功能的保护作用

高胜利1李莉2翟晓娟2郭任维2燕子3高淑红4

1.山西医科大学汾阳学院生理学教研室，山西汾阳032200；2.山西医科大学附属汾阳医院心血管内科，山西汾阳032200；3.山西医科大学生理学系，山西太原030001；4.山西医科大学汾阳学院统计学教研室，山西汾阳032200

目的探讨普罗布考对高同型半胱氨酸血症大鼠内皮功能的作用及机制。方法30只大鼠随机分为3组，对照组（10只）基础饲料饲养，高同型半胱氨酸血症（HHcy）组（10只）在基础饲料上添加3%L-蛋氨酸喂养4周，普罗布考组（10只）高蛋氨酸饲料喂养4周，同时给予普罗布考150 mg/d灌胃。喂养4周时检测各组大鼠胸主动脉血管内皮依赖性舒张功能、血浆一氧化氮（NO）、非对称性二甲基精氨酸（ADMA）含量和内皮型一氧化氮合酶（eNOS）活性，胸主动脉二甲基精氨酸二甲氨基水解酶（DDAH2）活性和蛋白质表达。结果HHcy组大鼠同型半胱胺酸（Hcy）含量显著升高，与HHcy组比较，普罗布考组大鼠Hcy含量降低（P＜0.01）。给予1×10-7～1×10-5mol/L累积浓度的乙酰胆碱后，HHcy组大鼠血管张力低于对照组和普罗布考组（P＜0.05）；给予1×10-8～1×10-4mol/L累积浓度的酸化亚硝酸钠（NaNO2）后，三组间的血管张力无明显差别（P＞0.05）。与对照组比较，HHcy组大鼠血浆NO含量降低（P＜0.05），eNOS活性降低（P＜0.01），ADMA含量增高（P＜0.05），胸主动脉DDHA2活性降低（P＜0.01）和蛋白质水平降低（P＜0.01）；与HHcy组比较，普罗布考组大鼠血浆NO含量增高（P＜0.01），eNOS活性增高（P＜0.05），ADMA含量降低（P＜0.01），胸主动脉DDHA2活性增高（P＜0.01）和蛋白质水平增高（P＜0.05）。结论普罗布考能降低高同型半胱氨酸血症大鼠血浆Hcy水平，改善动脉内皮依赖性舒张功能，其机制与DDAH/ ADMA/NOS/NO通路有关。

普罗布考；同型半胱氨酸；内皮依赖性舒张功能；一氧化氮；内皮型一氧化氮合成酶；非对称二甲基精氨酸；二甲基精氨酸二甲胺水解酶2

同型半胱氨酸（Homocysteinemia，Hcy）增高是心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）的一个独立危险因素［1］，血管内皮依赖性舒张功能（endothelium dependent dilation，EDD）下降是其发病原因之一［2］。EDD功能依赖于血管内皮的结构完整和功能正常，主要由一氧化氮（nitric oxide，NO）介导，NO由内皮一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）催化而成，非对称性二甲基精氨酸（asymmetric dimethylarginine，ADMA）是eNOS的抑制剂，可被二甲基精氨酸二甲氨基水解酶（dimethylarginine dimethylamino-hydrolase 2，DDAH2）特异水解［3］。普罗布考（Probucol）是一种降脂药物，具有提高DDAH2的表达、降低ADMA的活性和改善内皮功能的作用［4］。普罗布考能否降低高同型半胱氨酸血症（hyperhomocysteinemia，HHcy）大鼠的Hcy水平，改善EDD功能，目前相关报道较为少见，对此本研究进行探讨，现报道如下：

1　材料与方法

1.1主要试剂和仪器

L-蛋氨酸（天津天安药业股份有限公司）；普罗布考（齐鲁制药有限公司，国药准字H10980054）；大鼠Hcy、ADMA和eNOS酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒（武汉华美生物工程有限公司）；NO试剂盒（南京建成生物工程研究所）；β-actin一抗（北京中杉金桥生物计技术有限公司）；羊抗鼠DDAHⅡ（英国Abeam）；兔抗羊IgG-HRP（武汉博士德生物工程有限公司）；ECL化学发光剂（上海碧云天生物技术有限公司）。BL-420F生物机能实验系统（成都泰盟生物科技有限公司）；多功能酶标仪（美国伯腾仪器有限公司），UV755B分光光度计（苏州市莱顿科学仪器有限公司）。

1.2动物及模型制作

SD成年雌雄大鼠30只，6～8周龄，体重150～180 g，由山西医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：0701010。大鼠随机分为三组：对照组、HHcy组和普罗布考组，每组10只。对照组基础饲料饲养，HHcy组在基础饲料上添加3%L-蛋氨酸喂养4周，普罗布考组高蛋氨酸饲料喂养4周，同时给予普罗布考150 mg/d灌胃。

1.3实验方法

1.3.1大鼠血浆Hcy含量检测分别于喂养0、4周末眼眶采血，采用ELISA测定Hcy。

1.3.2大鼠胸主动脉内皮依赖性舒张功能检测大鼠4周时，用25%乌拉坦腹腔注射麻醉动物后，迅速取出胸主动脉，置于预冷的Krebs-Henseleit（K-H）溶液中，制备2～3 mm的动脉环，血管环用2个金属钩悬置于充以K-H溶液中，一端与张力换能器相连，持续通以95%O2+5%CO2的混合气体，以BL-420F生物机能实验系统进行记录和数据处理。以去氧肾上腺（PE，10 μmol/L）诱发最大收缩幅度为100%，以加入药品后的血管舒张幅度与最大收缩幅度之间的比率反映血管张力的变化。以累积给予1×10-9～1×10-5mol/L的乙酰胆碱（ACh）反映内皮依赖性舒血管功能；以累积给予1×10-8～1×10-4mol/L的酸化亚硝酸钠（NaNO2）反映非内皮依赖性舒血管功能。

1.3.3大鼠血浆NO、ADMA含量及eNOS活性检测大鼠4周时，眼眶采血，3000 r/min，离心15 min，分离血浆。NO测定采用硝酸还原酶法，ADMA及eNOS含量采用ELISA测定。

1.3.4大鼠胸主动脉DDHA2活性检测参照文献［5］，将大鼠胸主动脉环剪碎加入冰的磷酸缓冲液（0.1 mol/L pH6.5）制成5%的组织匀浆，取50 μL上清与1 mmol/L ADMA反应，并与二乙酰单肟（0.8%）和安替比林（0.5%）共孵育100 min，用UV755B分光光度计测定466 nm吸光度值，计算L-胍氨酸生成量反映DDAH2的活性。以对照组的DDAH2活性定为100%，其他各组的DDAH的活性以与对照组的百分比表示。1.3.5大鼠胸主动脉DDHA2蛋白质水平检测采用Western-blotting方法，将胸主动脉按1 mg组织加入10 μL含有多种蛋白酶抑制剂的组织裂解液，冰上裂解、匀浆，4℃离心后取上清，使用二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量后行SDS-PAGE电泳、转膜、封闭，分别加入β-actin一抗（1∶1000）和DDAH 2一抗（1∶2500），4℃孵育过夜，结合HRP二抗（1∶500）孵育2 h，加入ECL化学发光剂，暗室曝光，显影和定影。胶片扫描结果采用Quantity-one软件分析，将目的条带的光密度值与其相对应的内参β-actin的光密度值比较，所得比值代表该目的蛋白的相对含量。

1.4统计学方法

采用SPSS 20统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用LSD-t检验，多组间比较采用单因素方差分析（Oneway ANOVA），以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1大鼠血浆Hcy含量

喂养0周时，三组大鼠Hcy含量差异无统计学意义（P＞0.05）。喂养4周时，与对照组比较，HHcy组和普罗布考组大鼠Hcy含量显著升高。与HHcy组比较，普罗布考组大鼠Hcy含量降低，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。见表1。

表1　三组大鼠血浆Hcy含量变化比较（μmol/L，±s）

表1　三组大鼠血浆Hcy含量变化比较（μmol/L，±s）

与对照组比较，*P＜0.01；与HHcy组比较，#P＜0.01；HHcy：高同型半胱氨酸血症；Hcy：同型半胱氨酸

组别只数0周4周对照组HHcy组普罗布考组P值10 10 10 10.36±1.32 11.24±2.04 10.59±3.12＞0.05 12.03±2.35 32.55±3.38*22.23±2.87*#＜0.05

2.2大鼠主动脉内皮依赖性舒张功能

给予1×10-7～1×10-5mol/L累积浓度的Ach后，HHcy组大鼠血管张力低于对照组和普罗布考组（P＜0.05），见图2A；给予1×10-8～1×10-4mol/L累积浓度的酸化NaNO2后，三组间的血管张力比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见图2B。

A：给予累积浓度的Ach后大鼠血管张力；与对照组比较，**P＜0.05；与普罗布考组比较，##P＜0.05；B：给予累积浓度的酸化NaNO2后大鼠血管张力；Ach：乙酰胆碱；NaNO2：酸化亚硝酸钠

2.3大鼠血浆NO、eNOS及ADMA含量

与对照组比较，HHcy组大鼠血浆NO含量降低（P＜0.05），eNOS活性降低（P＜0.01）；与HHcy组比较，普罗布考组血浆NO含量增高（P＜0.01），eNOS活性增高（P＜0.05）。HHcy组大鼠血浆ADMA含量与对照比较，明显增高（P＜0.05）；与HHcy组比较，普罗布考组降低（P＜0.01）。见表2。

2.4大鼠胸主动脉DDHA2活性

与对照组比较，HHcy组大鼠胸主动脉DDHA2活性降低（P＜0.01）；与HHcy组比较，普罗布考组大鼠胸主动脉DDHA2活性增高（P＜0.01）。见表2。

表2　三组大鼠血浆NO、eNOS及ADMA含量及胸主动脉活性比较（x±s）

2.5大鼠胸主动脉DDHA2蛋白质水平

与对照组比较，HHcy组大鼠胸主动脉DDHA2蛋白质水平降低（P＜0.01）；与HHcy组比较，普罗布考组大鼠胸主动脉DDHA2蛋白质水平增高（P＜0.05）。见图2。

图2　DDHA2蛋白质的表达和DDHA2/β-actin比值

3　讨论

Hcy是蛋氨酸代谢的中间产物，是CVD的一个独立危险因素，一般认为血浆Hcy为5～15 μmol/L为正常，16～30 μmol/L为轻度HHcy，31～100 μmol/L为中度HHcy，Hcy＞100 μmol/L为重度HHcy。高剂量蛋氨酸饲养大鼠喂养可以导致血浆Hcy水平增高，本实验中HHcy组采用3%L-蛋氨酸喂养，4周后Hcy水平达到（32.55±3.38）μmol/L，说明成功制备高同型半胱氨酸血症大鼠模型。普罗布考具有调血脂和抗氧化作用，能否降低Hcy目前仍然存在着争议。在本研究中，普罗布考组较HHcy组血浆Hcy降低（P＜0.01），说明普罗布考具有降低Hcy的作用，与李玲等［6］的研究结果一致，而临床研究也证实了普罗布考具有降低Hcy的作用［7］，考虑与普罗布考阻断低密度脂蛋白胆固醇氧化，抑制氧化应激，减少氧化低密度脂蛋白胆固醇的生成，降低氧自由基浓度，影响Hcy代谢有关。

血管EDD功能是动脉粥样硬化和CVD的始动因素，Hcy可以导致EDD功能损伤［8］。EDD功能由NO介导，而NO由eNOS催化而成，ADMA是NOS的内源性抑制剂，ADMA主要通过DDAH2水解代谢。在本研究中，HHcy大鼠胸主动脉EDD功能下降，其血浆NO浓度下降、eNOS活性降低、ADMA水平升高，胸主动脉eNOS活性下降，DDAH2蛋白质表达下降，说明Hcy损伤内皮EDD功能与DDAH/ADMA/NOS/ NO通路有关，其原因可能是由于DDAH2活性中心包含一个活性必需的游离半胱氨酸残基，Hcy的半胱氨酸残基与此半胱氨酸残基形成二硫键，导致DDAH2失活，ADMA降解减少血浆浓度升高［9］，抑制了eNOS使NO合成减少，最终导致EDD功能功能下降［10］，与张敬各［11］的研究结果一致。

普罗布考具有调节血脂、抗氧化、稳定动脉粥样硬化斑块和改善血管内皮功能等作用，作为一种独特的抗动脉粥样硬化药物应用于临床［12-13］。研究表明，普罗布考可以改善动脉粥样硬化大鼠内皮依赖性舒张功能不全［14］。在本实验中，与HHcy组比较，普罗布考组大鼠EDD功能增强（P＜0.01），说明普罗布考可以改善HHcy大鼠胸主动脉的EDD功能。已有研究证实，普罗布考具有提高DDAH2的表达、改善内皮细胞DDAH活性，降低ADMA水平的作用［4，15］。本研究中，普罗布考治疗组血浆NO、eNOS活性均增高，而ADMA水平下降，胸主动脉DDAH2蛋白质表达增高。说明普罗布考通过增加DDAH2表达，降低ADMA水平，增加eNOS的活性，增加了NO，改善了EDD功能。说明了普罗布考可以提高HHcy大鼠主动脉DDAH2的表达，通过DDAH/ADMA/NOS/NO通路改善内皮EDD功能。由此可见，普罗布考不仅可以降低Hcy水平，而且可以通过DDAH/ADMA/NOS/NO通路改善HHcy大鼠都这么内皮EDD功能，为临床应用普罗布考预防和治疗HHcy提供理论依据。

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Protective effects of Probucol on endothelial function in rats with hyperhomocysteinemia

GAO Shengli1LI li2ZHAI Xiaojuan2GUO Renwei2YAN Zi3GAO Shuhong4
1.Department of Physiology，Fenyang College of Shanxi Medical University，Shanxi Province，Fenyang032200，China；2.Department of Cardiovascular Medicine，Fenyang Hospital of Shanxi Medical University，Shanxi Province，Fenyang 032200，China；3.Department of Physiology，Shanxi Medical University，Shanxi Province，Taiyuan030001，China；4.Department of Statistics，Fenyang College of Shanxi Medical University，Shanxi Province，Fenyang032200，China

Objective To investigate the effect and mechanism of Probucol on endothelial function in hyperhomocysteinemia rats.Methods 30 rats were randomly divided into three groups.Control group（10 rats）were feed in the basal diet；HHcy group（10 rats）in the basal diet added 3%L-methionine diet for 4 weeks；Probucol group（10 rats）of high methionine diet for 4 weeks，and was treated with Probucol 150 mg/d orally.Thoracic aortic EDD，plasma NO，ADMA content and eNOS activity of rats in each group were detected in 4 weeks；DDAH2 activity and protein expression in thoracic aorta were detected in 4 weeds.Results The content of Hcy in the rats of the HHcy group increased significantly，compared with the HHcy group，the Hcy content in the Probucol group rats was decreased（P＜0.01）.Given 1× 10-7-1×10-5mol/L Cumulative concentration of ACh，vascular tension in HHcy group rats were lower than control group and Probucol group（P＜0.05）；after given the cumulative concentration NaNO21×10-8-1×10-4mol/L，vascular tension between the three groups had no difference（P＞0.05）.Compared with the control group，plasma NO content was reduced（P＜0.05），eNOS activity was lower（P＜0.01），the ADMA content was increased（P＜0.05），aortic DDHA2 activity was decreased（P＜0.01）and protein level was decreased in HHcy group（P＜0.01）.Compared with HHcy group，plasma NO content were increased（P＜0.01），eNOS activity was increased（P＜0.05），the ADMA content were decreased（P＜0.01），the thoracic aortic DDHA2 ac-tivity was increased（P＜0.01）and protein level was increased（P＜0.05）in Probucol group.Conclusion Probucol can reduce the level of plasma Hcy in hyperhomocysteinemia rats，improve thoracic aorta endothelial dependent diastolic function，its mechanism is related to the DDAH/ADMA/NOS/NO pathway.

Probucol；Homocysteine；Endothelium dependent dilation；Nitric oxide；Endothelial nitric oxide synthase；Asymmetric dimethylarginine；Dimethylarginine dimethylamino-hydrolase 2

R589.2

A

1673-7210（2015）09（a）-0023-04

2015-04-28本文编辑：任念）

高胜利（1975-），男，硕士；研究方向：动脉粥样硬化。