M A PK信号通路在肺炎衣原体感染小鼠中的作用

吴　俊　刘建全　李慧萍　余　波

1.长江航运总医院检验科，湖北武汉430010；2.长江航运总医院心内科，湖北武汉430010

M A PK信号通路在肺炎衣原体感染小鼠中的作用

吴俊1刘建全1李慧萍1余波2

1.长江航运总医院检验科，湖北武汉430010；2.长江航运总医院心内科，湖北武汉430010

目的研究MAPK信号通路在肺炎衣原体（CP）感染APOE基因敲除（APOE）小鼠促进动脉粥样硬化形成中的作用。方法48只APOE小鼠分为感染-高脂组、高脂组、感染组和对照组，每组12只，喂养20周，采用Western blot和Real time-PCR法检测胞外信号调控激酶（p-ERK1/2）、p-P38的蛋白表达和白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF-α）的基因的表达。结果感染-高脂组、高脂组、感染组APOE小鼠的主动脉IL-6和TNF-α水平明显高于对照组（P＜0.05）。与对照组比较，感染-高脂组、高脂组、感染组p-ERK1/2、p-P38蛋白表达的水平显著降低（P＜0.05）。结论CP感染激发和加重动脉内炎性反应可促进动脉粥样硬化，MAPK信号通路是CP促进动脉粥样硬化的潜在机制。

动脉粥样硬化；白介素-6；丝裂原活化蛋白激酶

当今心脑血管疾病的发病率呈现逐年上升的趋势，随着全球人口老龄化的进程和生活饮食习惯的改变，发病人群有逐年增加和年轻化的趋势［1-2］。动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）作为心脑血管疾病的病变基础，其发病机制至今仍不明确［3-5］。近年来国内外一些研究发现，肺炎衣原体（chlamydia pneumoniae，CP）感染可能参与动脉粥样硬化病变的发生、发展过程［6］。

丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。MAPK信号通路在调控心血管疾病的研究中日益受到人们的重视。笔者以往研究已经证实，CP可以加速小鼠AS的形成。在此基础上本研究进一步探讨MAPK信号通路在CP对高脂诱导的APOE小鼠AS发病过程中的作用。

1　材料与方法

1.1动物实验及分组

48只健康雄性APOE小鼠，5周龄，体重15～18 g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供［动物许可证号：SYXK（鄂）2004-0028］，饲养条件：温度18～25℃，相对湿度50%～80%，每日光照12 h，摄食、饮水自由。普通饲料适应性喂养1周，再按照随机化原则将APOE小鼠分为4组，每组12只。对照组：常规饲料喂养，接种0.01 mol/L，pH 7.4 PBS缓冲液；感染组：常规饲料喂养，接种CP；高脂组：高脂饲料喂养，接种0.01 mol/L，pH 7.4 PBS缓冲液；感染-高脂组：高脂饲料喂养，接种CP。

1.2饲料配方

饲料普通饮食由同济医学院实验动物中心提供。高脂饮食按照Godfrey配方：脂肪21.00%，胆固醇0.15%，基础饲料78.85%［7］。

1.3肺炎衣原体培养

肺炎衣原体菌株（ATCC VR-1310），购于上海慧颖生物科技有限公司，在Hep-2细胞中传代培养，每0.5毫升冻存在-80℃冰箱至接种。接种物的浓度为1×107包涵体单位。将CP悬浮液及PBS缓冲液以鼻内途径接种小鼠。

1.4实验室试剂

pH 7.4 PBS缓冲液配方：NaCl 8.0 g，KH2PO40.2 g，Na2HPO4·12H2O 2.9 g，KCl 0.2 g将这些试剂按次序加入定量容器中，加适量蒸馏水溶解后，再定容至1000 mL，调pH值至7.4，高压消毒灭菌后备用。Trizol试剂购自美国Invitrogen公司。蛋白杂交PVDF膜购自美国Intergen公司。预染蛋白质分子量标准购自Bio-Rad公司。Western杂交显影用增强化学发光试剂购自Pierce公司。各种限制性内切酶购自大连宝生物TaKaRa公司。其余试剂为国产分析纯试剂。

1.5生化指标检测

实验在小鼠5、15和20周时进行，各组小鼠眼眶后窦静脉取血于EP管中，立即在4℃下3000 r/min离心10 min，取上层血清，用生化仪行总胆固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇检测。

1.6动脉标本采集

以2%戊巴比妥（30 mg/kg）经腹腔麻醉小鼠，眼球摘除法获得血液标本，各组取5只20周小鼠用生理盐水及4%多聚甲醛从左心室逆行灌注固定主动脉后，自主动脉根部至腹主动脉末端离断整个主动脉。

1.7免疫印迹法

采用Trizol试剂盒抽提纯化各样本蛋白质。①制SDS-聚丙烯酞胺凝胶缓冲液；②处理样品；③拔出梳子，将处理好的样品依一定次序加入点样孔中，同时点样Bio-Rad预染蛋白质标准5 μL作为分子量参照；④接通电源，垂直电泳分离蛋白质，开始时电压80 V，样品进入分离胶后电压加大到110 V。⑤配制1×转膜缓冲液，倒入托盘中；⑥电泳完成后，取出玻璃夹心，拆卸凝胶夹层，去除积层胶，切一块与凝胶大小相同的PVDF膜和2张滤纸；⑦组装转印夹层；⑧将转印夹夹紧，放入电泳槽中，25 V电压下4℃转膜过夜，将蛋白质通过电转移转至PVDF膜上；⑨将膜放入封闭液中室温下封闭2～3 h；⑩TBS-T洗膜后，加入单克隆抗体（1∶2000稀释），4℃摇动过夜；11用TBS-T于室温下洗膜4次，每次15 min；12加入辣根过氧化物酶（HRPO）偶联的羊抗兔IgG抗体（1∶8000稀释）；13采用化学发光底物进行发光显迹。

1.8Real-time PCR法

采用Trizol试剂盒抽提纯化各样本总RNA。采用Primer 5.0软件设计引物，TNF-α：上游5'-TGTTCATCCATTCTCTACCC-3'，下游5'-TCACTGTCCCAGCATCTTGT-3'；IL-6：上游5'-AGTCACAGAAGGAGTGGCTAAG-3'，下游5'-GAGGAATGTCCACAAACT GATA-3'；GAPDH：上游5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。反应体系是由7.2 μL DEPC水、10 μL SYBR Green Realtime PCR Master Mix、0.4 μL上游引物、0.4 μL下游引物和2 μL cDNA组成。反应条件：95℃30 s预温，95℃20 s、60℃20 s和72℃20 s做40个循环，72℃4 min退火。TNF-α含量（%）=TNF-α/GAPDH× 100%；IL-6含量（%）=IL-6/GAPDH×100%。

1.9统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1实验过程中小鼠体重变化

感染-高脂组、高脂组、感染组和对照组小鼠5、10、15、20周体重差异无统计学意义（P＞0.05），表明对于APOE小鼠无论高脂饮食还是CP感染，对小鼠体重均无明显影响。也就是说，AS的发生发展过程中体重不会发生显著变化。见图1。

图1　实验过程中小鼠体重变化

2.2各组APOE小鼠血脂水平比较

5、15周龄时各组总胆固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平差异无统计学意义（P＞0.05）。20周龄时，高脂组和感染-高脂组总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇水平显著高于对照组（P＜0.01），高密度脂蛋白胆固醇水平低于对照组（P＜0.05）；感染-高脂组的三酰甘油水平明显高于对照组（P＜0.05），高脂组和感染组的三酰甘油水平与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；感染组各指标水平与对照组间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。提示CP感染可以加重因高脂引起的AS血脂浓度。见表1。

表1　各组APOE小鼠血脂水平比较（mmol/L，x±s）

2.3各组20周龄动脉粥样硬化小鼠主动脉TNF-α、IL-6 mRNA表达水平比较

感染-高脂组、高脂组、感染组APOE小鼠主动脉IL-6和TNF-α mRNA含量明显高于对照组，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。提示高脂饮食引起APOE小鼠体内IL-6和TNF-α mRNA含量升高，CP感染也可以引起或加重高脂血症小鼠IL-6和TNF-α mRNA水平的升高。高脂组、感染组和感染-高脂组IL-6和TNF-α mRNA水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2、图2。

表2　各组20周龄动脉粥样硬化小鼠主动脉TNF-α、IL-6 mRNA表达水平比较（±s）

表2　各组20周龄动脉粥样硬化小鼠主动脉TNF-α、IL-6 mRNA表达水平比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.01

组别只数IL-6/GAPDHTNF-α/GAPDH对照组高脂组感染组感染-高脂组12 12 12 12 15.3±3.4 21.9±4.1*21.3±3.6*23.5±3.8*32.6±5.6 42.5±6.8*41.9±6.9*43.3±7.1*

2.4各组APOE小鼠p-P38和p-ERK1/2蛋白表达水平比较

感染-高脂组、高脂组、感染组APOE小鼠p-P38和p-ERK1/2蛋白表达水平均明显低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；感染-高脂组、高脂组、感染组间差异无统计学意义（P＞0.05）。提示高脂饮食引起APOE小鼠体内p-P38和p-ERK1/2表达水平降低，CP感染也可以引起或加重高脂血症小鼠p-P38和p-ERK1/2蛋白表达水平的降低。提示CP感染可能是通过减少肝脏中p-P38和p-ERK1/2的表达来促进AS的发生发展。见表3、图3。

图2　各组20周龄动脉粥样硬化小鼠主动脉TNF-α、IL-6 mRNA表达水平

表3　各组APOE小鼠p-P38和p-ERK1/2蛋白表达水平比较（±s）

表3　各组APOE小鼠p-P38和p-ERK1/2蛋白表达水平比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05

组别只数p-P38p-ERK1/2对照组高脂组感染组感染-高脂组12 12 12 12 0.43±0.08 0.34±0.05*0.36±0.05*0.34±0.06*0.48±0.05 0.41±0.04*0.42±0.06*0.41±0.05*

3　讨论

AS的发生发展与炎症相关，例如，CP、巨细胞病毒（HCMV）、幽门螺杆菌（Hp）等一些感染性因素有可能是AS的危险因子，尤其是CP感染，可促发人类心血管系统疾病的炎性反应。CP是一种严格细胞内寄生的病原体，通常引起上呼吸道和肺部感染［8-11］。CP经过呼吸道侵入到机体，再被单核巨噬细胞识别、吞噬，跟随血液循环侵入血管壁，可感染内皮细胞，参与AS的发病［12-14］。

图3　各组APOE小鼠p-P38和p-ERK1/2蛋白表达水平

活化MAPK通过磷酸化核转录因子、细胞骨架蛋白及酶类等参与细胞增殖、分化、转化及凋亡的调节，并与炎症、肿瘤等多种疾病的发生密切相关。MAPK在介导炎症过程中的激活和细胞因子生成中起着重要作用。在哺乳动物细胞中MAPK亚族主要包括ERK1/2、JNK、p38和ERK5，这几条通路之间存在相互协调、相互调控的关系［15-17］。ERK通路参与应激刺激、细菌产物、炎症介质等引起的细胞反应，表明ERK通路的激活与炎症密切相关［18］。JNK通路能被生长因子、脂多糖（LPS）、TNF-α、IL-1、热休克等激活。p38通路能被LPS、生血细胞因子［促红细胞生成素（EPO）］和IL-3、致炎细胞因子、细菌成分、热休克等激活。LPS介导的细胞炎性反应是一个典型的病原体与机体相互作用的过程。LPS刺激细胞激活ERK、JNK和P38，然后作用于各自的底物，影响多种转录因子的活性，从而调节包括TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等多种细胞因子在内的基因的表达。而TNF-α、IL-1、花生四烯酸（arachdonic acid，AA）产物、内皮素等多种炎症介质能激活不同MAPK，通过促进或抑制基因的转录来调控其他炎症介质的生成。最近，MAPK信号通路在调控心血管疾病的研究方面日益受到人们的重视［19］。

本研究表明，AS的发生发展过程中体重无显著变化。在血脂方面，小鼠20周龄时，感染-高脂组相比于对照组差异有统计学意义。这说明CP感染可以加重因高脂引起的AS血脂浓度。感染-高脂组、感染组和高脂组APOE小鼠的主动脉IL-6和TNF-α mRNA含量明显高于对照组（P＜0.01）。说明高脂饮食引起APOE小鼠体内的IL-6、TNF-α mRNA含量升高，CP感染也可以引起或加重高脂血症小鼠的IL-6、TNF-α mRNA水平的升高。感染-高脂组、感染组和高脂组APOE小鼠p-P38、p-ERK1/2蛋白表达水平明显低于对照组（P＜0.05），其三组间蛋白水平差异无统计学意义（P＞0.05）。提示高脂饮食引起APOE小鼠体内的p-P38、p-ERK1/2蛋白表达水平的降低，CP感染也可以引起或加重高脂血症小鼠p-P38、p-ERK1/2蛋白表达水平的降低。因而，CP感染是通过减少p-P38、p-ERK1/2蛋白表达水平来促进AS的发生发展。研究表明，在CP感染APOE小鼠过程中MAPK信号转导通路具有重要作用［20］。MAPK信号转导通路可通过P38和ERK来促进小鼠的AS［21］。

综上所述，笔者推测CP感染诱导APOE小鼠的AS机制可能与MAPK信号转导通路的激活有关。但CP感染诱导APOE小鼠AS中的作用还需要进一步研究，其联系以及相互作用机制的阐明将为探索AS有效防治途径提供新线索。

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Role of MAPK in chlamydia pneumoniae infection-induced mice

WU Jun1LIU Jianquan1LI Huiping1YU Bo2
1.Department of Clinical Laboratory，Yangtze River Shipping General Hospital，Hubei Province，Wuhan430010，China；2.Department of Cardiology，Yangtze River Shipping General Hospital，Hubei Province，Wuhan430010，China

Objective To investigate the role of MAPK in APOE mice induced atherosclerosis（AS）by chlamydia pneumoniae（CP）infection.Methods Forty-eight APOE mice were divided into four groups including CP infection and hyperlipidemia group，hyperlipidemia group，CP infection group and control group，each group had 12 mice.The mice were sacrificed at 20 week of age.Western blot and Real time-PCR were used to detect the p-ERK1/2，p-P38 protein expression and the gene expression of IL-6，TNF-α.Results The levels of IL-6 and TNF-α in CP infection and hyperlipidemia group，hyperlipidemia group，CP infection group were significantly higher than those in control group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.Compared with the control group，the levels of p-ERK1/2，p-P38 protein expression in CP infection and hyperlipidemia group，hyperlipidemia group，CP infection group significantly reduced，with statistically significant differences（P＜0.05）.Conclusion Infection with CP may contribute to AS by the initiation and progression of the inflammatory reaction within the artery.MAPK is a potential mechanism of CP induced AS.［Key words］Atherosclerosis；IL-6；MAPK

R543.5

A

1673-7210（2015）09（a）-0015-05

2015-01-30本文编辑：程铭）

湖北省武汉市卫计委临床医学科研项目（WX13C45）。

吴俊（1974-），女，硕士，副主任技师；研究方向：生物化学与分子生物学。