一株产脂肪酶菌株的筛选、鉴定及酶性质的研究

庄 岩，夏文旭，雷晨瑶，肖宇轩，舒宗美，赵 萍，陆界瑾，聂 霖，牛 军，王 雅

（兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730050）

一株产脂肪酶菌株的筛选、鉴定及酶性质的研究

庄 岩，夏文旭，雷晨瑶，肖宇轩，舒宗美，赵 萍*，陆界瑾，聂 霖，牛 军，王 雅

（兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730050）

本文对从土样中筛选出具有产脂肪酶的菌株Yz12进行显微镜检及分子鉴定，探索不同因素对菌株Yz12产酶条件的影响以及菌株Yz12酶学性质。结果表明，菌株Yz12最适温度为30℃；最适pH为8.0；碳源为橄榄油与蔗糖（3∶1）；氮源为（NH4）2SO4与牛肉膏（1∶2）以及最佳发酵时间为72h。Yz12脂肪酶最适温度为30℃；最适pH为7.0；Ca2+能促进Yz12脂肪酶的活力。经镜检及分子鉴定后，确定菌株Yz12为米曲霉Aspergillus oryzae。

菌株，脂肪酶，筛选，鉴定，酶活

Keywords∶ The raw coal sample； Heat of combustion； Determination； Renault correction plan

脂肪酶（Lipase）作为生物催化剂，是一类特殊酯键水解酶，随着酶固定化技术等相关研究的突破进展，人们对脂肪酶产生极大的兴趣。尽管目前已经克隆出低温脂肪酶的部分功能基因并成功表达，但低温脂肪酶基因的异源表达性能差限制了其在工业化生产中的应用［1］。

微生物脂肪酶因具有种类多、制剂纯度高等优点而得到广泛应用，尤其在油脂化工和有机合成工业［2］。伴随对生产脂肪酶微生物的深入研究，目前主要包括假单胞菌属（Pseudomonas sp.）、链霉菌属（Streptomyces sp.）、假丝酵母属（Candida sp.）、黑曲霉（Aspergillus niger）、根霉属（Rhizopus sp.）等。相对于来自动植物的酶，微生物酶具有大规模发酵工艺简单，易于培养等特点［3］。随着药物蛋白临床治疗和工业酶应用需求的日益增加，利用基因工程和蛋白质工程来实现重组酶的高水平表达以及筛选出新特性或高活力的酶来满足大规模纯化酶的生产需求［4-5］，因此，能否大规模分离纯化相应的微生物酶制品已成为当前生物工程中的一个关键性问题［6］。

本研究通过采集兰州理工大学学生食堂附近长期积油的土壤，从积油土样中分离筛选出产脂肪酶的菌株，进行多次复筛及纯化后，最终得到一株能产脂肪酶的高效菌株，并研究其产酶条件特性和酶学性质。

1、材料与方法

1.1材料及培养基

试样：采自于兰州理工大学学生食堂附近长期积油的土壤。

马铃薯培养基（PDA）：马铃薯200g，蔗糖（或葡萄糖）20g，琼脂18g，水1000mL，pH7，1×105Pa灭菌30min。

罗丹明B显色培养基：橄榄油2.0g、琼脂粉5g、K2HPO40.2g、MgSO4·7H2O 0.1g、（NH4）2SO40.4g至250mL蒸馏水，1×105Pa灭菌30min后加1mL 0.001mol/L罗丹明B。

油脂培养基：橄榄油2.0g、琼脂粉5g、K2HPO40.2 g、MgSO4·7H2O 0.1g、（NH4）2SO40.4g至250mL蒸馏水，1×105Pa灭菌30min。

复筛培养基：橄榄油3.0g，K2HPO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，（NH4）2SO41.5g，葡萄糖1.0g至150mL，1×105Pa灭菌30min。

1.2菌株Yz12的分离与纯化

取采集土样5.0g溶于10mL无菌水中，充分摇匀，静置片刻，取上层液体1mL于20mL PDA液体培养基中，30℃，150r/min，培养3d后，取1mL转接到新的PDA液体培养基中，同样条件下进行3次富集［7］。取最后一次富集菌液1mL到9mL无菌水中10倍稀释到10-7，取各梯度1mL，分别涂布于罗丹明B显色培养基和油脂培养基中，30℃，培养2-3d，将变色圈较大的菌落（罗丹明B显色培养基，365nm）和透明圈较大的菌落（油脂培养基）划线分离纯化，挑至PDA斜面培养基上保藏［8］。将PDA斜面培养基上保藏的菌株，用无菌水配成并稀释，将稀释成10-2的菌悬液分别放入复筛培养基中，30℃，150r/min 培养60h后，采用滴定法测定脂肪酶酶活性［9］，选择酶活最好的一株菌株，标记为：Yz12。

1.3菌株Yz12显微镜检及分子鉴定

制备PDA与油脂培养基，分别将菌株Yz12从斜面转接到PDA和油脂培养基上，30℃培养，并在3d后观察其形态。参照《细菌鉴定手册》与《真菌鉴定手册》进行形态学特征初步检测。

利用ITS rDNA两端的引物NS1（GTAGTCATATGCTTGTCTC）和NS8（TCCTCCGCTTATTGATATGC）扩增菌株Yz12的ITS rDNA基因，并进行DNA测序。筛选得到的菌株Yz12的PCR扩增及18S rDNA序列测序均由英茂盛业测序公司完成。

PCR扩增反应体系：基因组DNA 1.0µL、10×Buffer（含2.5mM Mg2+） 2.5µL、Taq聚合酶（5U/µL）0.5µL、dNTP（10mM）1.0µL、NS1（10µM） 0.5µL、NS8（10µM）0.5µL、ddH2O 0.5µL。PCR反应参数：95℃ 3min；95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 120s，35个循环［10］。

利用CLC DNA Workbench 6软件将获得序列与GenBank中收录的DNA序列进行比对，并与相关菌株构建进化树。根据形态学与分子特征来确定菌株Yz12的属种。

1.4各因素对菌株Yz12产酶条件的影响［11］

1.4.1温度对菌株Yz12产酶条件的影响

将菌株Yz12转接到装有150mL复筛培养基的锥形瓶中，分别在30、35、40、45和50℃下，150r/min，培养60h，检测其酶活力［12］。

1.4.2pH对菌株Yz12产酶的影响

将菌株Yz12转接到装有150mL复筛培养基的锥形瓶中，分别在pH为：5.0、6.0、7.0、8.0和9.0下，30℃，150r/min，培养60h，检测其酶活力。

1.4.3碳源对菌株Yz12产酶的影响

将菌株Yz12转接到装有150mL在复筛培养基基础上，改变其不同的碳源｛碳源分别为：蔗糖4.0g、葡萄糖4.0g、可溶性淀粉4.0g、葡萄糖+橄榄油（1∶3）4.0g、蔗糖+橄榄油（1∶3）4.0g｝的锥形瓶中，30℃，150r/min，培养60h，检测其酶活力。

1.4.4氮源对菌株Yz12产酶的影响

将菌株Yz12转接到装有150mL在复筛培养基基础上，改变其不同的氮源｛氮源分别为：（NH4）2SO41.5g、NH4Cl 1.5g、牛肉膏1.5g、蛋白胨1.5g、牛肉膏+（NH4）2SO4（2∶1）1.5g、蛋白胨+（NH4）2SO4（2∶1） 1.5g［13］｝的锥形瓶中，30℃，150r/min，培养60h，检测其酶活力。

1.4.5发酵时间对菌株Yz12产酶的影响

将菌株Yz12转接到含150mL复筛培养基的形瓶中，30℃，150r/min，分别培养36、48、60、72和84h，检测其酶活力。

1.5菌株Yz12酶学性质的测定［14］

1.5.1温度对菌株Yz12酶活的影响

将含有10mL 0.01mol/L硬脂酸钠与1g橄榄油的100mL乳化液（蒸馏水补足），加入5mL酶液后，分别在温度为25、30、35、40、45℃，并在各反应温度的10、20、30min后，分别测定其酶活（3次重复，下同）。

1.5.2pH对菌株Yz12脂肪酶活力的影响

将含有10mL 0.01mol/L硬脂酸钠与1g橄榄油的100mL乳化液（蒸馏水补足），加入5mL酶液后，分别在pH值为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，30℃，并在各pH值条件下，反应10、20、30min后，分别测定其酶活。

1.5.3金属离子对菌株Yz12酶活的影响

取10mL 0.5mmol/L的Mg2+、Cu2+、Fe2+、K+和Ca2+溶液分别加入到100mL的乳化液和未加离子的反应对照组中，加入5mL酶液，30℃，10min后，分别测定其酶活。

2、结果与分析

2.1菌株Yz12的镜检及18S rDNA基因鉴定结果

菌株Yz12在PDA培养基上生长迅速，菌落质地疏松，初白色，渐淡黄色，后为淡绿色至绿褐色；在油脂培养基上菌落生长缓慢，菌落呈黄绿色；分生孢子头呈放射状，直径约为200µm。分生孢子梗茎约为2mm，近顶囊处直径20µm左右，顶囊近球形小梗为单层，分生孢子呈球形（见图1）。

图1　Yz12 PDA培养基形态和棉蓝染色后分生孢子形态（400X）Fig. 1 the morphology of the Yz12 in the PDA culture medium and the spores of the cotton blue staining （400X）

利用CLC DNA Workbench 6软件将菌株Yz12的部分序列与GenBank中相关菌株的DNA序列进行比对，并构建进化树（见图2），同时根据GB/T 5009.22-2003中黄曲霉毒素B1的测定方法进一步检验菌株Yz12，最终确定该菌株为米曲霉Aspergillus oryzae。菌株Yz12的部分序列已提交至GenBank中，收录号为JX489381。

图2　菌株Yz12的18S rDNA序列系统发育分析Figure 2 The analysis of sequence phylogenetic of 18S rDNA of strain Yz12

2.2各因素对菌株Yz12产酶条件的影响

2.2.1温度对菌株Yz12产酶的影响

由图3可知，温度20-30℃，菌株Yz12的产酶能力随着温度增加而增加，在30℃以后产酶能力逐渐降低，因此，认为菌株Yz12的最适产酶温度为30℃。经鉴定，菌株Yz12为真菌，与细菌不同，温度对真菌的产酶影响较大且发酵温度在35℃以下比较适宜，产酶能力较好。

图3　温度对Yz12产酶的影响Figure 3 The influence of temperature on enzyme of Yz12

2.2.2pH对菌株Yz12产酶条件的影响

如图4所示，培养基初始pH从5.0到9.0变化时，菌株Yz12起初产的酶能力随着pH增加而增加，在8.0时开始趋于平缓，因此认为菌株Yz12的最适产酶pH为8.0，说明菌株Yz12在弱碱性条件下，有较好的产酶能力，这可能与菌株代谢产生酸性物质影响脂肪酶合成，释放有关，当pH继续增大时，产酶能力下降，这可能说明高的pH不适应这些菌株的生长。

图4　不同pH对Yz12产酶的影响Figure 4 The influence of different pH value of enzyme of Yz12

2.2.3碳源对菌株Yz12产酶条件的影响

在不同碳源组的检测酶活中，蔗糖组酶活为5.89U/mL，葡萄糖组酶活为7.20U/mL，橄榄油组酶活为4.47U/mL，橄榄油+葡萄糖组酶活为9.65U/mL，橄榄油+蔗糖组酶活为10.25 U/mL，可溶性淀粉组酶活为8.24U/mL。以橄榄油为C源时，Yz12产酶活最低，而当C源为橄榄油+蔗糖的混合时，产酶能力最高。一些研究指出以葡萄糖或蔗糖作为真菌产酶的C源可获得理想的发酵效果［15］，而本试验发现当C源为油脂和蔗糖的混合时，效果明显优于葡萄糖、蔗糖等，这一现象可能与微生物种类不同和测试方法不同所致。

2.2.4氮源对菌株Yz12产酶条件的影响

检测不同N源组酶活时，发现（NH4）2SO4组酶活为10.42U/mL，NH4Cl组酶活为10.27U/mL，牛肉膏组酶活为11.74U/mL，蛋白胨组酶活为9.43U/mL，（NH4）2SO4+牛肉膏组酶活为12.64U/mL，（NH4）2SO4+蛋白胨组酶活为11.22U/mL。N源是无机盐和有机氮时产酶能力相差不大，而当N源为（NH4）2SO4+牛肉膏混合时，产酶能力最高。据报道，脂肪酶的发酵生产多以牛肉膏、蛋白胨为N源［8］，而本试验发现当N源为牛肉膏+无机氮时，产酶效果要好于牛肉膏或蛋白胨。

2.2.5发酵时间对菌株Yz12产酶条件的影响

如图5可知，发酵时间从36-72h时，菌株Yz12的产酶能力随着时间增加而增加，在72h时开始降低，因此，菌株Yz12的最佳产酶发酵时间为72h。发酵时间越短，产酶能力基本与菌株的数量成正比，随着发酵时间的增长菌株趋于平稳，脂肪酶产生速率最高，但随着代谢不断的进行，酸性物质产生，影响膜的通透性，同时也抑制酶的生成。随着脂肪酶合成与释放减少，脂肪酶被其他蛋白酶代谢，其数量逐渐降低［16］。

图5　发酵时间对Yz12产酶量的影响Figure 5 The influence of fermentation time on enzyme production of Yz12

2.3菌株Yz12的酶学性质

2.3.1温度对菌株Yz12酶活的影响

由表1可知，菌株Yz12的脂肪酶最适温度为30℃，温度在35℃以下具有良好的稳定性，温度超过40℃时酶活活性快速下降。在45℃，30min后测定脂肪酶残留活力仅初始反应的20%左右。脂肪酶的热稳定性一直是脂肪酶生产和应用的关键问题，从自然界筛选高温脂肪酶菌种并获得对应基因，应利用基因克隆和重组等技术解决该问题。

表1　温度对Yz12菌株脂肪酶活力的影响（U/mL）Table 1 Effects of temperature on Yz12 lipase activity

2.3.2pH对菌株Yz12酶活的影响

由表2可知，菌株Yz12脂肪酶最适pH为7。随后pH值增大，菌株Yz12的酶活迅速下降。在3个反应体系中，pH在5.0-9.0中，菌株Yz12酶活都具有良好的稳定性。pH的高低会影响到酶在溶液中的分子结构，进而影响酶的活性，其次研究的溶液极性大小对酶分子的结构影响，能了解酶的催化特征，进而有效利用酶的活性［17］。

表2　pH对Yz12脂肪酶活力和稳定性的影响（U/mL）Table 2 Effects of pH on Yz12 lipase activity

2.3.3金属离子对菌株Yz12酶活的影响

脂肪酶的催化一般不需辅助因子，但如Mg2+、Ca2+等二价金属离子会对一些真菌脂肪酶有促进作用。在不同离子组及对照组的检测酶活中，发现对照组的酶活为10.81U/mL，Mg2+组的酶活为11.82U/mL，Cu2+组的酶活为9.53U/mL，Fe2+组的酶活为9.15U/mL，K+组的酶活为11.02U/mL，Ca2+组的酶活为12.53U/mL，由此可知，Ca2+组能促进菌株Yz12脂肪酶的活力；Mg2+、K+组比对照组稍高；Cu2+、Fe2+组比对照组稍低。

3、讨论

3.1经过选择性培养筛选出有明显白色水解圈和复筛测定酶活和观察白色水解圈，获得一株高效脂肪酶酶活菌株Yz12，结合微生物形态学与分子鉴定判定菌株Yz12为米曲霉Aspergillus oryzae。

3.2菌株Yz12最适产酶温度为30℃；最适产酶pH为8.0；碳源为橄榄油与蔗糖（3∶1）、氮源为（NH4）2SO4与牛肉膏（1∶2）；最佳产酶发酵时间为72h。

3.3菌株Yz12脂肪酶最适温度为30℃，在35℃以下具有良好的稳定性；最适pH 7.0，在pH 5.0-9.0时酶活较稳定；Ca2+能促进Yz12脂肪酶的活力。

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Isolation， identification and the enzyme properties research of a lipase producing strain

ZHUANG Yan， XIA Wen-xu， LEI Chen-yao， XIAO Yu-xuan， SHU Zong-mei， ZHAO Ping*，LU Jie-jin， NIE Lin， NIU Jun， WANG Ya（School of life science and engineering， Lanzhou University of Technology， Lanzhou， Gansu 730050， China）

To isolate and screen a strain Yz12 with high efficiency lipase from the soil sample， the isolation of Yz12 was carried out by microscopic examination and molecular identification. The influence of different factors on the production of Yz12 was studied， and the properties of Yz12 were determined. The most suitable temperature was 30. The optimal pH was 8. Carbon source was good for olive oil and sucrose （3∶1）， nitrogen source for ammonium sulfate and beef extract （1∶2）. The optimal fermentation time was 72h. Yz12 lipase activity was the most suitable temperature of 30. The best pH was 7. Ca2+ can promote the activity of Yz12 lipase. After microscopic examination and molecular identification， the strain Yz12 was identified as Aspergillus oryzae.

strains， lipase， screening， identification， enzyme activities

S154.39

A

甘肃省青年科技研究基金项目（1310RJYA022），国家科技支撑计划（2011BAD15B03）

庄岩（1982-），男，讲师，硕士，研究方向为生物质资源的开发与利用。

赵萍（1964- ），女，教授，硕士，硕士生导师，研究方向为食品科学、副产物综合利用研究，