CBHⅡ和EGⅣ的重构基因在里氏木霉中的组成型表达

曾敏，邓丽瑜，汤新，刘刚，余少文，*

（1.深圳大学生命科学学院，深圳市微生物基因工程重点实验室，广东深圳518060；2.深圳大学生命科学学院，深圳市海洋生物资源与生态环境重点实验室，广东深圳518060）

CBHⅡ和EGⅣ的重构基因在里氏木霉中的组成型表达

曾敏1，2，邓丽瑜1，汤新1，刘刚1，余少文1，*

（1.深圳大学生命科学学院，深圳市微生物基因工程重点实验室，广东深圳518060；2.深圳大学生命科学学院，深圳市海洋生物资源与生态环境重点实验室，广东深圳518060）

重构基因cbh2-linker-CDeg4表达的融合蛋白同时获得具有外切葡聚糖酶CBH II和内切葡聚糖酶EG IV 2种催化活性，在纤维素降解等方面有着重要应用。本研究通过overlap PCR将里氏木霉丙酮酸脱羧酶（PDC）的启动子、纤维二糖水解酶cbh1的信号肽、重构基因cbh2-linker-CDeg4和pdc终止子依次连接，以质粒pPICZαA为基本骨架，构建表达载体pPIC-PCT。采用原生质体转化法将pPIC-PCT和含潮霉素抗性筛选标记的质粒pAN7-1共转里氏木霉。SDS-PAGE分析表明，重构基因cbh2-linker-CDeg4实现了在里氏木霉中的组成型表达，测得重组木霉发酵上清液的CMCNa酶活最高达到4.08 U/mL，是出发菌株的5.55倍，FPA酶活达到0.915 U/mL，较出发菌株提高了43.6%。酶学性质初步研究表明：粗酶液的最适pH为5.0，最适温度为50℃。

基因重构；外切葡聚糖酶Ⅱ；内切葡聚糖酶Ⅳ；丙酮酸脱羧酶启动子

纤维素酶能有效降解纤维素，将其水解成葡萄糖，广泛应用于纺织、食品加工、酿酒、造纸和饲料等领域，对解决环境污染和能源危机具有重大意义［1-2］。纤维素酶广泛存在于多种微生物中，其中里氏木霉（Trichoderma reesei）是目前研究最透彻的产纤维素酶模式菌株［3-4］，它产生的纤维素酶主要由内切型葡聚糖酶（endo-glucanases，EG）、外切型葡聚糖酶（exo-cel－lobiohydrolase，CBH）以及β-葡萄糖苷酶（β-Glucosi dase，简称BG）组成［5-7］，它们通过协同作用降解纤维素［8］。其中只有CBH可作用于纤维素结晶区域，从纤维素分子的非还原端进行水解，而自然界中的木质纤维素大都呈结晶状态，因此CBH在纤维素降解过程中的作用非常重要。纤维素酶有2个活性区域：催化结构域（catalytic domains，CD）和纤维素结合结构域构（celluose-binding domains，CBD）［9-10］，其中CD是纤维素酶的“活性中心”，在水解过程中起着重要作用。

根据纤维素酶各组分间的协同作用研究，人们发现适当改变各组分的比例可提高纤维素酶的降解效率。近年来，从分子结构水平改造纤维素酶基因，提高纤维素酶的生物学活性已经取得了重大进展。Lemos［11］等在基因cbh2和eg中增加CBD基因，提高了这两种纤维素酶的活性。刘刚等［12］在eg4基因中增加一个其自身的CD基因，使其重组蛋白活性提高了4倍。本实验室在cbh2下游增加eg4的CD基因，得到含2个催化结构域的重构基因cbh2-linker-CDeg4。本研究将该基因与里氏木霉丙酮酸脱羧酶的组成型强启动子（含信号肽）融合，构建里氏木霉组成型表达转化系统，以期得到可以高效表达融合蛋白CBHⅡ-EGⅣ且具有较高酶活力的重组木霉。

1　材料与方法

1.1菌株及质粒

T.reesei QM9414、大肠杆菌E.coli Top10F’、质粒pPICZαA、pAN7-1由本实验室保藏。pMD18-T simple vector购自TaKaRa公司。质粒pPIC-cbh2，pPIC-eg4由本实验室前期构建。

1.2培养基

Mandels基础培养基：Mandels营养盐浓缩液100 mL/L，Mandels微量元素浓缩液1.0 mL/L，无水葡萄糖10 g/L，蛋白胨1.0 g/L，1 M的柠檬酸缓冲液（pH4.5）50 mL/L，吐温80 1.0 g/L～2.0 g/L。

筛选培养基：含有STC和潮霉素100 μg/mL的PDA培养基。其中，STC、葡萄糖和PDA培养基的其他成分分为3部分各溶于约1/3的水中。

产酶培养基：50×Mandels营养盐浓缩液20 mL/L，1 000×Mandels微量元素浓缩液1.0 mL/L，黄豆饼粉50 g/L，1 M柠檬酸缓冲液（pH 4.5）50 mL/L，吐温80 1.0 g/L～2.0 g/L，葡萄糖30 g/L。

1.3表达载体pPIC-PCT的构建

分别以实验室前期构建的质粒pPIC-eg4、pPIC-cbh2为模板，根据NCBI公布eg4、cbh2序列设计引物，经PCR获得基因片段linkereg4、CDeg4和cbh2。依次经双酶切连接至质粒pPICZαA，重构质粒pPIC-cbh2-linker-CDeg4。

以里氏木霉基因组DNA为模板，根据Genebank报道的序列设计引物，分别经PCR扩增获得纤维二糖水解酶I信号肽序列Scbh1、丙酮酸脱羧酶启动子Ppdc和终止子Tpdc序列。利用overlap PCR技术依次连接PSpdc、cbh2-linker-CDeg4、Tpdc，构建表达载体pPIC-PCT。

1.4里氏木霉的原生质体转化及筛选

表达载体pPIC-PCT经Xba I酶切纯化处理后，与含潮霉素筛选标记的质粒pAN7-1共转T.Reesei，主要参照Penttila等的方法进行［13］。取适量转化液涂布到含有100 μg/mL潮霉素的PDA平板上，28℃培养观察3 d～5 d至平板上长出菌丝，挑取单菌落菌丝转接至100 μg/mL潮霉素的PDA小平板上进行复筛，28℃培养2 d，再转接至新鲜无抗性PDA小板上培养7 d～10d。

1.5重组木霉的组成型表达

用无菌水刮取PDA培养平板上生长7 d的木霉转化子孢子，接种至含潮霉素抗性的Mandels基础培养基中，28℃，220 r/min振荡培养1.5 d～2 d。以5%的接种量转接至产酶培养基中，28℃，220 r/min，振荡培养。11 000 r/min，离心10 min，收集上清，即为粗酶液，每24 h取样一次检测粗酶液的酶活力。

1.6重组木霉的PCR鉴定

以重组木霉基因组DNA为模板，PCR扩增重构基因cbh2-linker-CDeg4，以木霉基因组DNA为对照，用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测并测序。

1.7重组木霉表达产物的分析

SDS-PAGE电泳：取粗酶液进行SDS-PAGE，分析融合蛋白CBHⅡ-EGⅣ的表达情况。

CMCNa酶活的测定：采用DNS法测定内切葡聚糖酶的活性［14］，酶活力单位（U）定义为1 min水解生成1 μmol葡萄糖所需的酶量。取适当稀释后的粗酶液0.5 mL与1%CMC-Na（用0.05 M柠檬酸缓冲液配制，pH4.8）于50℃水浴中反应30 min，立即加入3 mL DNS终止酶反应，充分混匀，沸水浴5 min，冷却，充分混匀后测OD540。每组实验做3个重复。

滤纸酶活（FPA）的测定：取0.5 mL适当稀释后的粗酶液、1 mL柠檬酸缓冲液（0.05 M，pH4.8）及50 mg的滤纸条（Whatman NO.1）在50℃水浴中反应30 min，立即加入3mLDNS终止酶反应，充分混匀，沸水浴5min，冷却，充分混匀后测OD540。每组实验做3个重复。

1.8重组木霉酶学性质的初步研究

酶反应的最适pH：分别配制pH为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的0.05 mol/L的柠檬酸缓冲液，在对应pH条件下进行CMCNa酶活测定。

酶反应的最适温度：分别在30、40、50、60、70、80℃下进CMCNa酶活测定。

2　结果与分析

2.1表达载体的构建

通过酶切连接法获得大小为2 205 bp的重构基因cbh2-linker-CDeg4，将该基因插入PSpdc和Tpdc之间，构建表达载体pPIC-PCT，大小约为7 000 bp，其测序结果与预期相符，可用于后续转化实验（如图1）。

图1　表达载体pPIC-PCT的酶切鉴定Fig.1Enzyme digestion of the recombined plasmid pPIC-PCT

2.2重组木霉的PCR鉴定

如图2所示：可在大部分重组木霉的基因组中扩增到重构基因cbh2-linker-CDeg4，且测序结果与预期一致，表明重构基因cbh2-linker-CDeg4已成功整合到到里氏木霉基因组中。

图2　重组木霉基因组的PCR鉴定Fig.2Identification of recombinant T.reesei by PCR

2.3SDS-PAGE分析

融合蛋白CBHⅡ-EGⅣ在pdc启动子的调控下，成功实现了在里氏木霉中的组成型表达。SDS-PAGE电泳分析结果表明（图3），融合蛋白CBHⅡ-EGⅣ的分子量约为100 KD，大于理论值80.56 KD，推测是重组蛋白在表达时发生了糖基化修饰。

图3　重组木霉的SDS-PAGE分析Fig.3Analysis of of recombinant T.reesei by SDS-PAGE

2.4重组木霉菌株的酶活测定

在相同条件下对重组木霉菌株及出发菌株进行组成型产酶实验，测得重组木霉A4的CMCNa酶活最高，达到4.08 U/mL（图4），是出发菌株的5.55倍。重组木霉A4的FPA酶活为0.915 U/mL（图5），较出发菌株提高了43.6%。由于初始菌体浓度较低，前48 h内几乎检测不到A4的CMCNa酶活和FPA酶活，96、84 h其酶活分别达到最高。培养108 h时，CMCNa酶活和FPA酶活均下降，可能是由于融合蛋白被里氏木霉自身分泌的蛋白酶所降解。

图4　重组木霉A4的CMCNa酶活Fig.4CMCNaactivity of recombinant T.reesei

图5　重组木霉A4的FPA酶活Fig.5FPA activity of recombinant T.reesei

2.5酶学性质的初步研究

如图6所示，粗酶液的最适pH为5.0，在pH为4.0～5.5范围内相对酶活较高，pH过低或过高都对酶活有较大影响。

图6　粗酶液的最适pHFig.6The optimum pH of crude enzyme

如图7所示，粗酶液的最适反应温度为50℃，在50℃～60℃范围内相对酶活较高，在70℃时还能保持最高酶活的66.6%，当温度达到80℃时，酶活急剧下降。

图7　粗酶液的最适温度Fig.7The optimum temperature of crude enzyme

3　结论与讨论

纤维素酶应用广泛，但因酶活低、成本高等因素不能进行大规模工业化生产和应用［15］。近年来，通过基因工程技术来获得高活性、高产量的纤维素酶逐渐受到重视。本研究对纤维素酶cbh2和eg4进行重构，获得具有2个催化结构域的重构基因，它表达的蛋白具有这2种纤维素酶组分的催化活性，在实际应用中具有更广阔的前景。

里氏木霉能高效合成和分泌蛋白质，是高产纤维素酶的代表菌种。它常使用cbh1启动子构建表达系统［16-18］，实现目的基因的同源或异源表达，但cbh1启动子需要纤维素或乳糖的诱导才能调控目的基因的表达。此外，诱导物也能诱导里氏木霉其它纤维素酶的表达，加大了目的蛋白分离、纯化的难度。LI等［19］通过RT-qPCR技术从里氏木霉中筛选出可以使木聚糖酶Ⅱ基因（xyn2）高效表达的pdc启动子，且里氏木霉分泌的总蛋白中约83%是XYN2蛋白。WANG等［20］利用pdc启动子调控康氏木霉纤维素酶转录激活因子xyr1的表达，结果显著提高了纤维素酶的活性。pdc组成型启动子所构建的表达系统无需诱导物，能在富含葡萄糖的培养条件下启动基因的转录。里氏木霉自身分泌蛋白较少，能有效解决目的蛋白的分离及纯化问题。本研究利用pdc启动子实现了重构基因cbh2-linker-CDeg4在里氏木霉中的组成型表达，其CMCNa酶活达到4.08 U/mL，是出发菌株的5.55倍，FPA酶活达到0.915 U/mL，较出发菌株提高了43.6%，大大提高了酶活力。

综上所述，重构基因cbh2-linker-CDeg4在pdc启动子的调控下，实现了在里氏木霉中的组成型高效表达，且杂蛋白较少，容易提纯。酶学性质研究表明，粗酶液的最适pH为5.0，最适反应温度为50℃。cbh2-linker-CDeg4同时具有cbh2和eg4的催化活性，在食品、饲料、纺织等工业有着广泛应用前景。今后，我们将对产酶培养基进行优化，通过改变对酶活影响较大的3个因素（碳源、氮源、无机盐）来确定最优培养方案，进一步提高该融合蛋白的酶活。今后将对该蛋白进行纯化，并对其酶学性质做详细研究。

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Construction of CBH II and EG IV for Homologous Protein Expression with Constitutive Promoter in Trichoderma Reesei

ZENG Min1，2，Deng Li-yu1，TANG Xin1，LIU Gang1，YU Shao-wen1，*
（1.College of Life Science，Shenzhen Key Laboratory of Microbial Genetic Engineering，Shenzhen University，Shenzhen 518060，Guangdong，China；2.College of Life Science，Shenzhen Key Laboratory of Marine Bioresources and Ecology，Shenzhen 518060，Guangdong，China）

The reconstructed gene cbh2-linker-CDeg4gain two kinds of cellulase catalytic properties，which added the catalytic domain（CD）gene from eg4 to the 3'end of cbh2.The gene cbh2-linker-CDeg4was inserted between T.reesei QM9414 strong promoter PSpdc（including secreting signal peptide sequence）and terminator Tpdc，generating reconstructed plasmid pPIC-PCT.The plasmid pPIC-PCT and plasmid pAN7-1 were transformed into T.reesei via an improved protoplast transformation.SDS-PAGE analysis showed that the fusion protein CBHⅡ-EGⅣhad successfully expressed in T.reesei.The CMCNaactivity of the T.reesei recombinants could reach 4.08 U/mL，which is 5.55-fold as high as that of the host strain；the FPA cativity could reach 0.915 U/mL，which were increased by 43.6%.The cellulase characterization of recombinant showed that the optimum pH value was about 5.0，and the optimum reaction temperature was at 50℃．

gene recombination；cellobiohydrolaseⅡ；endo-β-1，4-glucanaseⅣ；pyruvate decarboxylase promoter

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.13.032

2014-03-12

深圳市基础研究计划（JCYJ20120613115323982）

曾敏（1988—），女（汉），硕士研究生，研究方向：酶工程。