核磁共振脉冲宽度法测定婴幼儿乳粉中乳糖、蔗糖含量

姜 洁，李 玮，路 勇，何 涛，赵雅松，宋丽萍

（北京市食品安全监控和风险评估中心，北京100041）

核磁共振脉冲宽度法测定婴幼儿乳粉中乳糖、蔗糖含量

姜 洁，李 玮，路 勇，何 涛，赵雅松，宋丽萍

（北京市食品安全监控和风险评估中心，北京100041）

建立了乳粉中乳糖、蔗糖的NMR脉冲宽度定量分析法。以已知浓度的顺丁烯二酸为定量外标，利用核磁信号互易原理实现对分析物的定性、定量分析。结果表明，本方法中乳糖、蔗糖在标准品与外标摩尔浓度比为0.05～5.00范围内线性良好，相关系数均大于0.999；平均加标回收率为100.19%～103.21%，相对标准偏差在1.79%～3.57%之间。与现行的国家标准婴幼儿乳粉中乳糖、蔗糖含量测定方法（GB 5413.5-2010）相比，该方法具有操作简便，取样量小，选择性好，无需标准品作参比等优点，适于乳粉样品中乳糖、蔗糖含量的快速测定。

核磁共振，脉冲宽度定量，婴幼儿乳粉，乳糖，蔗糖

核磁共振氢谱定量（qHNMR，Quantitative1H Nuclear Magnetic Resonance）技术发展迅猛，目前已被广泛的用于药物质量控制［1-3］、代谢组学［4-5］、食品科学［6-8］等研究领域。qHNMR分析法以结构测定为基础，有着选择性好，样品无需分离，可同时测定被测样品中多种成分含量等优点。传统的qHNMR内标法是在样品中加入已知量的化合物作为校正参比内标，将被测样品定量质子的信号峰面积与内标物定量信号峰面积进行比较，最终确定样品的浓度。因此，内标物应满足含量准确，溶解性好，其定量峰与待测组分定量峰的化学位移相近并能完全分离，纵向弛豫时间T1要小于被测物T1等要求。食品样品基质复杂，在实际应用中很难找到合适的内标物，因此外标qHNMR分析方法更适合食品样品的检测。NMR脉冲宽度定量（Pulse Length Based Concentration Determination，PULCON）技术，以核磁信号强度互易原理（Princip le of Reciprocity in NMR Signal Strength）［9-11］为基础，在同一个探头中通过先后测定分别放入两个核磁管中外标物和样品的1H-NMR谱定量峰信号面积及90°脉冲宽度，即可完成对分析物的无内标qHNMR绝对定量。与NMR电信号内标分析法［5，12-13］相比，PULCON不用改变仪器的硬件，操作简单，使用方便。Gerhard等［14］将这一技术应用于蛋白质的NMR定量分析，但目前，尚未见小分子的应用报道［15］。

乳糖是6个月以内婴儿主要能量来源，对婴幼儿的生长发育有着重要的作用。乳粉中添加蔗糖可以改善乳粉口味，但婴幼儿食用过量的蔗糖会危害身体健康，如引发儿童期肥胖、增加得龋齿的风险等。目前，现行的食品安全国家标准中，婴幼儿乳粉中乳糖和蔗糖含量的测定方法推荐高效液相色谱法和莱因-埃农氏法［16］。但莱因-埃农氏法存在滴定条件不易控制和终点难以确定的缺点，而高效液相色谱法配合示差折光检测器的稳定性重复性和选择性均有一定程度的不足［17］。本研究运用多种NMR技术，对乳粉重水（D2O）溶液中乳糖、蔗糖的主要1H-NMR谱特征信号峰进行了确认，以建立乳粉中乳糖、蔗糖的PULCON分析方法。该法检测速度快、操作简单、取样量少，无需标准品及内标，旨为食品快速检测领域研究提供一种可选的分析方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乳糖、蔗糖、顺丁烯二酸标准品 美国SIGMA公司；重水（D2O，99.9%）、DSS［3-（三甲基硅基）-1-丙磺酸钠］美国CIL公司；婴幼儿配方乳粉样品（1、2、3号样品分别为2、1、3段婴幼儿配方奶粉） 购于市内某超市。

Bruker AVANCE 600MHz超导傅立叶变换核磁共振仪 配有BBO探头和topspin3.2处理软件，瑞士Bruker公司；Norell 5mm核磁管 美国Norell公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准储备液及外标溶液的配制 精确称取一定量的乳糖、蔗糖标准品，用D2O分别配制成100mmol/L的标准储备液，置冰箱-20℃条件下保存。精确称取适量顺丁烯二酸，用D2O配制成10mmol/L的外标液，移取600μL于核磁管中作为外标定量管。

1.2.2 样品制备 称取乳粉样品20mg于离心管中，加入1m L D2O，充分振摇，静置5m in后，过0.22μm滤膜。取滤液600μL于核磁管中，备用。

1.2.3 采样参数 实验使用的核磁共振仪1H载波频率为600.13MHz，实验温度为300K，采样次数NS为64次，空扫次数DS为2次，采样点TD为64K，谱宽SWH为6009.62Hz，外标脉冲延迟时间D1为40.0s，样品D1为10.0s。

1.2.4 PULCON定量原理及计算公式 PULCON定量技术的基础是NMR信号强度互易原理［10］，该原理可被描述为：将含有磁性原子核（自旋量子数不为零）的样品放置于具有强磁场环境的线圈中，原本杂乱无章的微观核磁矩会在宏观上形成按强磁场方向排列的磁化强度（M）。给线圈通入单元直流电使其在样品处产生一射频场（B1），该线圈接收到的由M进动所产生的感应信号强度（S）与B1成正比。

简单地说，对在一个给定的核磁线圈中的样品，其射频90°脉冲宽度与信号检测灵敏度成反比。根据这一原理，给定NMR线圈测定样品的信号强度S可以用公式（2）表示［12］：

式中，S为样品信号强度；c为物质的摩尔浓度；T为实验时探头的温度（K）；B90为已调谐、匹配好的NMR线圈测得的样品90°脉冲射频场强；Blu为单位电流在体积单元dV上产生的场强；M为在dV上垂直于静磁场方向的磁化强度。

由于射频场强B90与90°脉冲宽度成反比，当液体样品在线圈z方向的有效体积足够时，在样品有效体积区间内对公式（2）积分，就可将在同一线圈中独立测定的两个1H-NMR谱图信号强度和浓度联系起来，即：

式中，c为物质的摩尔浓度；S为定量峰积分面积；n为定量峰所包含的质子数；θ90为90°脉冲宽度；T为实验温度；下标U及R分别代表被测物和外标物；fT为修正因子，当定量外标物和被测物使用同一个脉冲在短时间内先后测定时，fT可视为等于1。

通过分别测定已知浓度定量外标物和被测物的定量峰峰面积、90°脉冲宽度，将其带入公式（3）进行计算，就可得到样品中被测物的绝对含量。

1.2.5 标准溶液的配制及曲线绘制 准确吸取一定体积的乳糖、蔗糖标准储备液，制为混标。用D2O将混标逐级稀释，配制成乳糖、蔗糖浓度均为0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0mmol/L的6个混合标准样品溶液。在1.2.3项条件下，首先测定外标管的1H-NMR谱，再依次测定上述6个混标溶液的1H-NMR图谱。计算测定被测物定量峰面积与90°脉冲宽度乘积和外标物峰面积与90°脉冲宽度乘积的比值，以此比值为纵坐标，被测物的浓度与外标物浓度的比值（CU/ CR）为横坐标做线性回归。

1.2.6 精密度实验 准确吸取混合标准品D2O溶液（乳糖、蔗糖浓度均为5mmol/L）600μL于核磁管中，在1.2.3项条件下分别测定外标物和混标的定量信号峰峰面积和脉冲宽度，1d内重复6次，以计算精密度。

1.2.7 重现性实验 按1.2.2项下方法平行制备6份样品溶液，在1.2.3项条件下分别测定外标物和样品的定量信号峰峰面积和脉冲宽度，计算值。

1.2.8 稳定性实验 取同一样品溶液，分别于0、2、4、6、8、12、24、48h进行测定，在1.2.3项条件下分别测定外标物和样品各时间点的定量信号峰峰面积和脉冲宽度，计算值。

1.2.9 加标回收率实验 平行称取12份乳粉样品，其中3份作为对照，余下分别加入低、中、高3个不同浓度的标准品溶液，每个添加水平重复3次，按1.2.2项下方法制备，在1.2.3项条件下测定1H-NMR图谱，计算回收率和标准偏差（RSD）。

1.2.10 样品测定 实验前，使用ASTM标准管精确校准90°脉冲宽度。按照1.2.3项下条件，首先测定外标的1H-NMR谱，完成后设置D1=10.0s，余下参数不变，测定各待测样品的1H-NMR图谱。测定每个样品前都要调谐和匹配探头、精细匀场、测定并记录对应的90°脉冲宽度。测得的定量图谱使用Bruker Topspin 3.2软件处理，变换点数为96K，用指数窗函数处理，基线和相位校正均采用手动方式进行。乳糖、蔗糖信号确认实验的1H-NMR图谱以DSS定标；其余所有1H-NMR图谱参照确认实验的图谱信号，以蔗糖中葡萄糖基的端基质子定标。每个样品的积分面积取5次积分的平均值。

2 结果与分析

2.1 乳粉样品1H-NMR谱中乳糖和蔗糖特征峰确认、定量峰及外标物的选择

测定乳糖、蔗糖标准品在D2O中的1H-NMR谱，结合HMQC、HMBC、1H-1H COSY等2D-NMR图谱对乳糖、蔗糖1H-NMR谱信号峰进行归属。由于端基碳的两个质子间的两面角不同其耦合常数也不同。对于呋喃型葡萄糖和半乳糖来说，β构型端基碳两个质子之间的两面角接近180°，它们的偶合常数（J1，2）接近8.0Hz；α构型端基碳两个质子之间的两面角接近60°，它们的J1，2接近4.0Hz，因此，根据端质子的偶合常数可以判断糖的构型。通过对乳糖、蔗糖标准品（D2O）的1H-NMR谱中端基质子耦合常数的分析可知，蔗糖在D2O中只存在一种构型，乳糖在D2O中存在两种构型（图1），与文献报道相符［7，18］。结合以上信息，对乳粉样品1H-NMR谱图（图2）中乳糖、蔗糖的特征信号进行确认（表1）。利用这些特征信号，可以实现对乳粉样品中乳糖和蔗糖的无标样定性分析。

图1 乳糖、蔗糖在D2O中构型Fig.1 Configurations of lactose and sucrose in D2O

图2 乳粉样品的1H-NMR谱（D2O）Fig.2 1H-NMR spectrum ofmilk powder（D2O）

表1 乳粉样品1H-NMR谱中乳糖、蔗糖特征信号（D2O）Table 1 The1H-NMRdataoflactoseand sucrose in sample（D2O）

蔗糖和乳糖均为二糖，糖环上多数质子的化学环境比较相近。在图2中，这些质子的1H-NMR信号分布在δH3.0～4.0范围内，峰与峰多有重叠，裂分情况难以归属（如图2e），因此不能用于定量分析。但由于糖的端基质子受到的去屏蔽作用明显强于环上其他质子，因此糖的端基质子一般会出现在δH4.3～5.5的低场区，很易辨识。在图2中，蔗糖和乳糖分子中的葡萄糖基和乳糖分子中半乳糖基的四个端基质子信号（a、b、c、d）与样品中其他成分信号无重叠，峰形尖锐，易于辨认。但乳糖中葡萄糖基的端基质子有α（δH5.17）和β（δH4.61）两种构型，且在D2O中可相互转化，不宜用于定量。所以，最终选定乳糖中半乳糖基端基质子信号峰d（δH4.39）和蔗糖中葡萄糖基的端基质子信号峰a（δH5.35）分别作为乳糖和蔗糖的定量峰。

PULCON法定量使用的是外标校正，因此定量外标物的选择不用考虑其溶解性、信号重叠、弛豫时间等因素。顺丁烯二酸结构简单，实验结果显示，仅在δH6.34（D2O）处有一尖锐单峰（文中未列出），易于辨认，故选定为定量外标物。

2.2 实验条件的选择

2.2.1 采样参数 为了避免造成样品饱和，一般D1≥5T1［19］。反转恢复法测得乳糖、蔗糖、顺丁烯二酸定量峰的弛豫时间T1分别为1.51、1.12、6.52s。所以，样品D1=10.0s，外标物D1=40.0s。脉冲的作用是为了建立x-y平面磁化强度，在倾倒角为90°时，信号最大，但即使是同一台仪器，产生90°倾倒角所必须的脉冲宽度也会经常变化。因此，在对每个样品进行采样前，都要重新测定本次检测90°脉宽并记录下具体数值，用于最后的浓度计算。NS较少会造成数据重现性差，较多会使数据重现性好，提高信噪比，但同时也会延长实验时间。因此，NS一般取64次即可满足一般分析的要求。采样时外标物和样品要使用相同的增益值（RG），以保证每个图谱信号的增益比例相同［20］。

2.2.2 图谱处理及样品体积 定量图谱处理时，为避免图谱间积分差异，在傅立叶变换前，各图谱要套用同一指数窗函数，变换点数也要相同。公式（3）是在线圈内样品有效体积上对公式（2）积分的结果，因此，在使用PULCON法定量时，NMR样品管中样品体积不能小于线圈测试的有效体积，但大于有效体积的部分不会影响浓度的测定。对于一般的常规探头，使用5mm的核磁管，450μL样品就能满足检测要求［14］。

2.3 方法学考察

2.3.5 加标回收率实验 加标回收率实验结果见表2，平均加标回收率为100.19%～103.21%，相对标准偏差在1.79%～3.57%之间。确认本方法回收率良好。

表2 乳粉中乳糖、蔗糖的加样回收率（n=3）Table 2 The results of recoveries of lactose and sucrose（n=3）

2.4 实际样品含量测定

采用上述方法对市售的3个品牌的婴幼儿乳粉样品进行测定，结果见表3。结果显示，三个奶粉样品测定结果与标签中标注的糖含量（1号样品55.1g/100g；2号49.5g/100g；3号样品54.7g/100g）基本相符。实验表明，本法样品前处理操作简单，选择性好，无需标准品及内标物，适用于同时测定和确证婴幼儿乳粉中的乳糖、蔗糖。

表3 婴幼儿乳粉样品中乳糖、蔗糖测定结果Table 3 Contents of lactose and sucrose in infant formulamilk powder determined by thismethod

3 结论

本研究以已知浓度的顺丁烯二酸为定量外标，建立了乳粉中乳糖、蔗糖含量的PULCON分析法，解决了传统核磁定量法中内标物对qHNMR使用的限制问题。方法学验证结果表明，2种糖标准品的线性相关系数均大于0.999，平均加样回收率为100.19%～103.21%，且精密度、稳定性和加标回收率的RSD值均小于4%，说明该方法具有准确、稳定、重复性好、加样回收率高的优点，可用于乳粉中乳糖、蔗糖的含量测定。

qHNMR法以结构测定为基础，因此，在对目标分析物检测的同时，通过对样品图谱中其他信号峰的分析，还能够实现对样品中非目标物的筛查，为婴幼儿乳粉的质量控制提供新的研究思路。本方法对样品的前处理只需要溶解过滤，简单快速，无需标准品做参比，适合大批量样本的快速检测。

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Determination of lactose and sucrose in infant formula milk powder by PULCON1H-NMR method

JIANG Jie，LIWei，LU Yong，HE Tao，ZHAO Ya-song，SONG Li-ping
（Beijing Municipal Center for Food Safety Monitoring and Risk Assessment，Beijing 100041，China）

A proton nuclear magnetic resonance quantification called PULCON was established for determination of lactose and sucrose in infant formula milk powder.Using the known concentration of maleic acid as the external standard，the concentration of analyte in two NMR spectra could be correlated by the NMR principle of reciprocity.For the two analytes，the calibration curves established showed good linearity over the concentration range of 0.05～5.00（R2＞0.999），and the average recoveries（n=3）were 100.19%～103.21%with RSD of 1.79%～3.57%.The high universality，selectivity，non-standard and efficiency of the PULCON method demonstrated in this work suggested that this method could serve as a highly potential alternative for determination of lactose and sucrose in milk powder，compared with the current national food safety standard（GB 5413.5-2010）.

NMR；PULCON；infant formula milk powder；lac tose；sucrose

TS201.2

A

1002-0306（2015）08-0068-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.005

2014－06－17

姜洁（1972-），女，博士，高级工程师，研究方向：食品营养与安全。