生白术对高原缺氧大鼠小肠运动和5-HT4受体的影响*

陈嘉屿 刘德科 吴红梅 刘熙钰 王彪猛 马 强 许 英

兰州军区总医院消化科1(730050) 体检中心2 甘肃省中医学校3

高原环境特征为低压、低氧、高寒、高辐射、气候多变［1］，高原缺氧引起的胃肠道功能紊乱临床上主要表现为腹泻、便秘、腹痛、腹胀、消化不良、恶心呕吐、食欲减退等症状，甚至可出现呕血、黑便和便血，并增加原有肠道炎症性疾病的发作风险［2-4］，严重影响急进高原者的健康和生活。然而，目前对急进高原者胃肠道运动功能紊乱的发生机制仍不明确，相关干预研究较少。5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)是参与调节胃肠运动的重要神经递质，其作用发挥系由相应受体所介导，5-HT及其受体异常在胃肠道功能紊乱中发挥重要作用。研究发现中药白术对胃肠运动具有双向调节作用［5］，本研究以高原缺氧大鼠模型为研究对象，通过观察其小肠推进率、小肠组织病理学变化和5-HT4受体表达，探讨高原缺氧对大鼠小肠运动的影响及其可能机制以及生白术的干预作用。

材料与方法

一、实验动物和主要试剂、仪器

清洁级 Wistar大鼠70只，雌雄各半，体质量(200±20)g，由兰州军区总医院动物实验中心提供，许可证号:SYXK(2012-0029)。中药生白术(市售，产地浙江)，马来酸曲美布汀胶囊(0.1 g/粒，国药准字H20040713，山西振东安特生物制药有限公司)，5-HT4受体兔抗鼠多克隆抗体(Abcam plc.)，多聚HRP标记抗兔IgG二步法免疫组化检测试剂盒、DAB显色液(北京中杉金桥生物技术有限公司);FLYDWC50-ⅡC低压低氧动物实验舱(贵州风雷氧舱有限公司)，JD-801形态学图像分析系统(江苏省捷达科技发展有限公司)。

二、方法

1.动物分组和造模:70只Wistar大鼠随机分为7组，分别为对照组(兰州海拔，1430 m)、3500 m海拔模型组和相应海拔曲美布汀、生白术干预组、5000 m海拔模型组和相应海拔曲美布汀、生白术干预组，每组10只。各组大鼠自由饮食，6组造模大鼠置于低压低氧舱中，急进速度0.3 m/s，直至达到设置的海拔高度，舱内温度22～25℃，造模时间3 d。造模过程中无大鼠死亡。

2.药物干预:曲美布汀组和生白术组分别予相应药物溶液1.35 g/L和540 g/L灌胃，每次2 mL，每日2次，共3 d。对照组和模型组予等体积0.9%NaCl溶液灌胃。

3.小肠推进率测定:3 d后所有大鼠予2 mL墨汁灌胃，30 min后处死，测量小肠(幽门至回盲部)长度和墨汁在小肠内的推进距离，小肠推进率=墨汁推进距离/小肠长度×100%。

4.小肠组织病理学检查:于距幽门2 cm处剪取长度为1 cm的小肠组织，0.9%NaCl溶液洗净，4%中性甲醛溶液固定24 h，常规脱水，石蜡包埋，横断面切片，片厚4 μm，HE染色，光学显微镜下观察。小肠黏膜病理变化评分标准:①炎性细胞浸润:无或少量(正常)，0分;单视野下≤5%(轻度)，1分;5% ～20%(中度)，2分;＞20%(重度)，3分。②腺体减少:无腺体减少(正常)，0分;减少≤1/3(轻度)，1分;1/3～2/3(中度)，2分;＞2/3(重度)，3分。③黏膜表层坏死或脱落:无或少量(正常)，0分;损伤≤1/3(轻度)，1分;1/3～2/3(中度)，2分;＞2/3(重度)，3分。总分为3项评分之和的均值。

5.5-HT4受体免疫组化染色:小肠组织切片脱蜡、水化，3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，PBS洗涤，加入一抗5-HT4受体兔抗鼠多克隆抗体(1∶300)，37 ℃温箱孵育90 min，PBS洗涤，依次加入试剂1和试剂2，37℃温箱各孵育20 min，PBS洗涤，加入DAB显色液，37℃温箱孵育5 min，自来水冲洗，苏木精复染，脱水，透明，封片，光学显微镜下观察。5-HT4受体阳性细胞呈棕色，分布于黏膜层和肌层。每张切片随机选取5个10×40倍视野，以形态学图像分析系统计算5-HT4受体免疫阳性面积，结果取均值。

三、统计学分析

结 果

一、小肠推进率

模拟海拔3500 m时，模型组大鼠小肠推进率明显减缓，与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05);曲美布汀组和生白术组小肠推进率较模型组有所加快，但仅生白术组差异有统计学意义(P＜0.05)，与对照组相比无明显差异(P ＞0.05)(表1)。

模拟海拔5000 m时，模型组大鼠小肠推进率明显加快，与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05);曲美布汀组和生白术组小肠推进率较模型组有所减缓，差异均有统计学意义(P＜0.05)，其中曲美布汀组与对照组相比仍有显著差异(P＜0.05)，生白术组与对照组相比则无明显差异(P＞0.05)(表1)。

表1 各组大鼠小肠推进率比较(，%)

表1 各组大鼠小肠推进率比较(，%)

＊与对照组比较，P＜0.05;▲与同海拔模型组比较，P＜0.05;△与同海拔曲美布汀组比较，P＜0.05

二、小肠组织5-HT4受体表达

模拟海拔3500 m时，模型组大鼠小肠组织5-HT4受体免疫阳性面积明显减少，与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05);曲美布汀组和生白术组5-HT4受体免疫阳性面积较模型组有所增加，但仅生白术组差异有统计学意义(P＜0.05)，与对照组相比无明显差异(P＞0.05)(表2、图1)。

模拟海拔5000 m时，模型组大鼠5-HT4受体免疫阳性面积明显增加，与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05);曲美布汀组和生白术组5-HT4受体免疫阳性面积较模型组有所减少，差异均有统计学意义(P＜0.05)，与对照组相比则均无明显差异(P ＞0.05)(表2、图1)。

表2 各组大鼠小肠组织5-HT4受体免疫阳性面积比较()

表2 各组大鼠小肠组织5-HT4受体免疫阳性面积比较()

＊与对照组比较，P＜0.05;▲与同海拔模型组比较，P＜0.05;△与同海拔曲美布汀组比较，P＜0.05

三、小肠组织病理学变化

模拟海拔3500 m时，模型组大鼠小肠黏膜中度损伤，病理评分与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05);曲美布汀组和生白术组小肠黏膜损伤较模型组有所减轻，但仅生白术组病理评分与模型组相比差异有统计学意义(P＜0.05)，与对照组相比无明显差异(P＞0.05)(表3、图2)。

模拟海拔5000 m时，模型组大鼠小肠黏膜重度损伤，病理评分与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05);曲美布汀组和生白术组小肠黏膜损伤较模型组有所减轻，两组病理评分与模型组和对照组相比差异均有统计学意义，生白术组与曲美布汀组间差异亦有统计学意义(P均 ＜0.05)(表3、图2)。

图1 各组大鼠小肠组织5-HT4受体免疫组化染色(×400)

图2 各组大鼠小肠组织病理学变化(HE染色，×200)

表3 各组小肠黏膜损伤病理评分比较()

表3 各组小肠黏膜损伤病理评分比较()

＊与对照组比较，P＜0.05;▲与同海拔模型组比较，P＜0.05;△与同海拔曲美布汀组比较，P＜0.05

讨 论

高原环境气候恶劣，可引起神经系统功能紊乱，胃肠激素和神经递质分泌异常，进而影响胃肠道运动功能。急进高原缺氧引起的胃肠道运动功能紊乱又称胃肠型高原反应，发病率较高，患者胃肠道运功功能的改变因海拔高度不同而异，临床表现多样，海拔3500 m时，肠道运动呈抑制状态，蠕动缓慢;海拔高达5000 m时，肠道运动功能紊乱，蠕动加快。上述变化的发生机制可能与机体反应能力有关，3000 m海拔为机体反应的临界高度，随着海拔的增高，空气含氧量逐渐降低，机体通过神经体液调节以满足重要脏器的血氧供应，导致肠道血氧供给减少，肠蠕动减慢;海拔高达5000 m时，空气含氧量进一步降低，机体无法完成自我调节以满足组织细胞的基本需求，导致各组织器官功能紊乱，肠蠕动加快。本实验中模型组大鼠在模拟海拔3500 m时表现为小肠推进率减缓，在模拟海拔5000 m时表现为小肠推进率加快，与上述理论相符，证实高原缺氧引起的小肠运动功能紊乱与海拔高度密切相关。

5-HT主要由胃肠道黏膜层的肠嗜铬细胞合成、分泌，参与胃肠道运动、分泌和感觉功能的调节以及脑-肠轴的调控，研究显示5-HT可通过5-HT4受体调节肠道蠕动反射和平滑肌张力，从而发挥促动力作用［6-9］。5-HT4受体广泛分布于人类胃肠道黏膜层、黏膜下层和肌层，神经细胞、平滑肌细胞、上皮细胞中均可检测到5-HT4mRNA表达［9］。5-HT激动肠肌丛神经节细胞上的5-HT4受体可引起平滑肌收缩，张力增加，使肠蠕动加快;激动平滑肌细胞上的5-HT4受体则可导致平滑肌舒张;肠上皮细胞中的5-HT4受体则主要参与肠道分泌功能的调节［10-12］。本实验结果显示，在模拟的高海拔缺氧环境中，模型组大鼠小肠黏膜损伤明显，黏膜表层中至重度坏死脱落，腺体减少，炎性细胞浸润，海拔越高，黏膜损伤越重;小肠组织中5-HT4受体的变化与小肠运动功能的变化相一致，3500 m较高海拔时，5-HT4受体数量减少，小肠推进率减缓，5000 m高海拔时，5-HT4受体数量增加，小肠推进率加快。推测小肠运动功能紊乱与小肠组织缺氧损伤，使5-HT4受体表达分布异常有关。

根据中医学理论，高海拔环境下机体缺氧可致脾胃气虚无力，运化功能失常。中药白术为菊科植物白术的干燥根茎，性温，味甘、苦，归脾、胃经，具有健脾益气、燥湿利水、止汗安胎之功效，可用于脾虚食少、腹胀泄泻等症的治疗。药理学研究发现白术对胃肠道平滑肌具有兴奋和抑制的双向调节作用［5］，既可治疗脾虚泄泻，又可治疗气虚便秘。张印等［13］发现大剂量生白术能明显促进小鼠小肠推进功能;赵文龙等［14］发现生白术能升高脾虚模型大鼠的血清胃泌素和生长抑素水平，缓解脾虚症表现出的便溏、纳呆、少动等表征;吴翰桂等［15］的研究显示白术可增强小鼠小肠平滑肌收缩幅度和频率，并改善其抗缺氧能力，对胃肠道运动有明显促进作用。由此推测生白术可能对缺氧所致脾胃气虚引发的胃肠道症状有一定改善作用。本实验以生白术干预高原缺氧模型大鼠，结果显示其对模型大鼠3500 m较高海拔时的肠蠕动减缓和5000 m高海拔时的肠蠕动加快均有明显改善作用，效果优于阳性对照药物马来酸曲美布汀，同时小肠组织5-HT4受体数量发生相应变化，小肠黏膜损伤明显减轻，提示生白术可能通过调节5-HT4受体有效改善高海拔缺氧环境下的小肠运动功能紊乱，对小肠黏膜损伤亦有一定修复作用。

综上所述，急进高原缺氧引起的胃肠道运动功能紊乱与海拔高度关系密切，临床表现各异，不论是预防还是治疗都应区别对待。生白术作为治疗胃肠道疾病的常用中药，可能通过提高机体免疫、调节胃肠激素和神经递质等多个途径实现对胃肠道功能的调控。本研究结果为生白术用于胃肠型高原反应的防治提供了实验依据，其对5-HT4受体发挥调节作用的确切机制有待进一步研究。

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